Nhóm lợn tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn có hiệu giá kháng thể trung hòa tăng dần sau khi tiêm vắc xin. Đối chiếu với ngưỡng dương tính theo tiêu chí của OIE, hiện tượng chuyển dương tính xảy ra tại thời điểm D35 (1 tuần sau khi tiêm vắc xin mũi 2). Mặc dù vậy, đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng dương tính chỉ duy trì được 3 tuần (sau tiêm vắc xin mũi 2). Đối chiếu tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8685-10: 2014 dễ nhận thấy vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn không đạt chỉ tiêu hiệu lực (hiệu giá kháng thể trung hòa cao nhất không vượt được mức quy định ≥ 2 log10).
Hình 4.8. So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng trung hòa
Với cùng lượng kháng nguyên gây miễn dịch (7 log10 TCID50) và sử dụng quy trình gây miễn dịch 2 lần, nhưng đáp ứng miễn dịch ở lợn tại thời điểm 56
ngày của nhóm tiêm vắc xin bổ trợ nhũ dầu thực sự cao hơn hẳn so với nhóm tiêm vắc xin bổ trợ keo phèn. Trong khi vắc xin bổ trợ nhũ dầu kích thích lợn sản sinh miễn dịch vượt ngưỡng bảo hộ (VNT = 2,49 log10 > tiêu chuẩn 2 log10) thì vắc xin bổ trợ keo phèn vẫn thấp hơn ngưỡng bảo hộ (VNT = 1,37 log10).
Nhằm có thêm thông tin trước khi kết luận về loại chất bổ trợ tốt nhất dùng sản xuất vắc xin vô hoạt, nhóm nghiên cứu sử dụng phản ứng LPB-ELISA để so sánh hiệu giá kháng thể trung hòa giữa nhóm lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và nhóm lợn tiêm vắc xin keo phèn (trình bày ở hình 4.7 nêu trên). Hình ảnh đĩa phản ứng LPB-ELISA và kết quả so sánh được trình bày tại hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả LPB-ELISA phát hiện kháng thể trung hòa ở lợn
Phản ứng LPB-ELISA là một dạng blocking ELISA, do đó, mẫu có kháng thể đặc hiệu sẽ khóa các vị trí kháng nguyên ở trên bề mặt vi rút LMLM và dẫn tới không hình thành được liên kết giữa kháng thể bắt - vi rút - kháng thể đặc hiệu 2 - kháng kháng thể. Vì vậy, phản ứng dương tính (có kháng thể trung hòa) sẽ không hiện màu. Cụ thể, ở hình 4.9, mẫu 1 có kháng thể trung hòa đến ngưỡng pha loãng huyết thanh 1/64, mẫu 2 có hiệu giá trung hòa ở mức 1/256.
Kết quả đối chiếu hiệu giá kháng thể trung hòa bằng phản ứng LPB-ELISA giữa 2 nhóm lợn sau gây miễn dịch được trình bày ở hình 4.10.
Nhìn chung, kết quả so sánh đáp ứng miễn dịch bằng phản ứng LPB-ELISA (hình 4.10) tương đương với kết quả thực hiện bằng phản ứng trung hòa vi rút (hình 4.8). Trong đó, chỉ xác định được kháng thể trung hòa trên ngưỡng bảo hộ (theo TCVN) ở nhóm lợn được miễn dịch bằng vắc xin nhũ dầu tại thời điểm 56 ngày sau vắc xin mũi 1 (4 tuần sau vắc xin mũi 2).
Hình 4.10. So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng LPB-ELISA
Tổng hợp kết quả ở hình 4.8 và hình 4.10 cho thấy, đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt có cùng nồng độ kháng nguyên nhưng phối trộn với chất bổ trợ khác nhau đã có sự khác biệt. Lợn được tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn cũng có biến động hiệu giá kháng thể nhưng hiệu giá kháng thể không ổn định và không kéo dài. Còn đối với lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu thì đáp ứng miễn dịch tăng chậm và có miễn dịch kéo dài và ổn định hơn khi tiêm mũi thứ 2.
Theo các nghiên cứu trước, vắc xin có công thức bổ trợ nhôm hydroxit và/hoặc saponin tạo ra đáp ứng miễn dịch kém trên lợn. Vắc xin có bổ trợ dầu khoáng, được phát triển thành công để sử dụng trên lợn, có khả năng bảo vệ ở đa số các loài (Doel, 2003; Park & cs., 2014). Hơn nữa, việc sử dụng chất bổ trợ keo phèn để sản xuất vắc xin cho lợn, khi tiêm cho lợn sẽ gây ra u cục, sưng tại vị trí tiêm (Valtulini & cs., 2005). Từ những kết quả và lập luận trên đây, nghiên cứu này kết luận: (i) chất bổ trợ ảnh hưởng đến sự hình thành đáp ứng miễn dịch đạt ngưỡng bảo hộ của vắc xin LMLM chế từ chủng vi rút O3; (ii) nhũ dầu là chất bổ trợ phù hợp cho sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt.
4.4. KHẢ NĂNG BẢO HỘ CHÉO ĐỐI VỚI CHỦNG VI RÚT THỰC ĐỊA
Hệ gen của vi rút LMLM luôn biến đổi, kéo theo đặc tính kháng nguyên
biến đổi. Do tính đa dạng về các subtýp trong cùng một týp huyết thanh học, việc tiêm phòng với subtýp này có thể không bảo vệ chống lại subtýp khác hoặc không hoàn toàn bảo hộ với các phân nhóm (lineage) trong cùng một subtýp. Do đó, vắc xin LMLM lý tưởng là loại vắc xin phổ bảo hộ rộng, phòng được nhiều chủng. Đây là vấn đề lớn trong việc kiểm soát bệnh LMLM. Mức độ bảo hộ có đạt được hay không là tuỳ thuộc vào ba yếu tố là: hiệu giá kháng thể được kích thích tạo ra, mức tương đồng kháng nguyên giữa các chủng vắc xin và chủng thực địa và lịch tiêm phòng.
Theo khuyến cáo của OIE, việc sản xuất vắc xin phân lập từ chủng vi rút thực địa được nhiều nước trên thế giới quan tâm và áp dụng để đảm bảo tính tương đồng giữa vi rút vắc xin và vi rút thực địa (Paton & cs., 2005). Phương pháp tiếp cận đơn giản nhất là tính giá trị liên quan (“r1” value) giữa vi rút thực địa, vi rút vắc xin với huyết thanh của động vật được miễn dịch bằng chủng vi rút vắc xin. Trong nghiên cứu này, một số chủng phân lập (cùng nhóm và khác nhóm topotype với vi rút vắc xin O3) đã được chọn để làm phản ứng trung hoà chéo với huyết thanh thu được của lợn (tại thời điểm 56 ngày) sau khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu. Kết quả xác định hiệu giá trung hòa chéo và chỉ số r1 được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4. Giá trị r1 của chủng vắc xin với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA
Mẫu huyết thanh VNT1 (x log10) V1 V2 V3 V4 V5
* Hiệu giá kháng thể trung hòa đồng chủng (VNT1): huyết thanh gây miễn dịch bởi virus vắc xin cho trung hòa vi rút vắc xin; hiệu giá kháng thể trung hòa dị chủng (VNT2): huyết thanh gây miễn dịch bởi
Hiệu giá kháng thể trung hòa đồng chủng của 5 mẫu huyết thanh (V1- V5) dao động từ 2,10 log10 - 2,70 log10 (cột 2, bảng 4.4) đều vượt ngưỡng dương tính kháng thể trung hòa theo tiêu chuẩn của OIE (>1,65 log10) và đạt ngưỡng bảo hộ theo TCVN (≥ 2,0 log10). Hiệu giá kháng thể trung hòa dị chủng của 5 mẫu huyết thanh nói trên với 3 chủng vi rút thuộc cùng topotype ME-SA dao động từ 1,36 log10 - 2,10 log10. Sự giảm về hiệu giá trung hòa đó phản ánh mức độ không tương đồng kháng nguyên tính ở một mức độ nhất định giữa các chủng
vi rút LMLM trong cùng topotype. Kết quả xác định giá trị tương quan r1 được trình bày ở hình 4.11.
Giá trị r1 từ vị trí số 1-5 là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi rút O/Manisa; vị trí 6-10 là là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi rút O/VN/HN1/2013 và vị trí 11- 15 là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút
vắc xin O3 với chủng vi rút O/VN/HT1/2015
Hình 4.11. Chỉ số tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút vắc xin với các chủng vi rút trong cùng topotype ME-SA
Dễ nhận thấy toàn bộ các giá trị r1 thu được đều > 0,3 (giới hạn bởi đường nét đứt màu đỏ, hình 4.11). Kết quả này phản ánh mức tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút vắc xin O3 với 3 chủng vi rút thuộc cùng topotype. Ở Việt Nam, trong một nghiên cứu công bố năm 2016, chỉ số r1 cũng đã được dùng để đánh giá tương đồng kháng nguyên giữa các chủng vi rút LMLM týp O thu thập
ở cả 3 miền Bắc- Trung- Nam (Ngô Thanh Long & cs., 2016). Ở nghiên cứu đó, 29/ 29 chủng vi rút đại diện từ thực địa đều cho giá trị r1 > 0,3, với 79,31% vi rút thực địa có r1 ≥ 0,5. Như vậy, cũng cần mở rộng phạm vi đánh giá mức tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút vắc xin O3 với các chủng vi rút LMLM thực địa khác thuộc týp O.
Bên cạnh việc sử dụng các chủng vi rút phân lập thuộc cùng topotype ME- SA, thí nghiệm tiếp tục thực hiện với các chủng vi rút O thuộc phân nhánh ME- SA/Ind2001, O/SEA - Mya98 và Cathay. Kết quả được trình bày trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Giá trị r1 của chủng vắc xin với các topotype O lưu hành ở Việt Nam TT 1 2 3 4
*Hiệu giá kháng thể trung hòa (VNT)
* Khả năng bảo hộ được đánh giá dựa vào sự kết hợp 2 tham số là hiệu giá kháng thể trung hòa và mức tương đồng kháng nguyên r1. Theo đó vắc xin được đánh giá là: (i) “có khả năng bảo hộ cao” nếu giá trị
r1 ≥ 0,3 & VNT ≥ 1,42; (ii) “khó dự đoán” nếu Giá trị r1 ≥ 0,3 & VNT < 1,42
Kết quả trên bảng 4.5 cho thấy, giá trị r1 đối với từng chủng vi rút thuộc các nhóm là khác nhau. Trong đó, giá trị r1 cao nhất là 0,95 của vi rút thuộc topotype O/SEA –Mya98, sau đó đến vi rút thuộc topotype O/ME-SA/Ind2001
với r1 = 0,71; thấp nhất là r1= 0,47 của vi rút thuộc topotype O/Cathay so với vi rút vắc xin. Mặc dù vậy, các kết quả r1 đều > 0,3. Theo khuyến cáo của OIE, điều này cho thấy vi rút vắc xin O3 (O/FMD/Avac3) có mức tương đồng cao đối với các vi rút thực địa thuộc 3 topotype hiện diện ở Việt Nam.
Sau khi tiêm vắc xin, hiệu giá kháng thể cao chỉ chứng minh vi rút có đặc tính sinh miễn dịch cao và ngược lại. Hiệu giá kháng thể cao, nhưng động vật vẫn không được bảo hộ đối với chủng vi rút thực địa nếu không có tính tương đồng với chủng vi rút gây bệnh ngoài thực địa. Mục đích cuối cùng của vắc xin là bảo vệ động vật cảm thụ chống lại vi rút thực địa. Cho nên việc xác định mức tương đồng kháng nguyên của vi rút sản xuất vắc xin và vi rút thực địa là điều hết sức cần thiết. Kháng thể đặc hiệu do vi rút chủng O3 tạo ra trên lợn có khả năng trung hoà chéo với các chủng được chọn đại diện từ các ổ dịch và các năm khác nhau. Điều này cho thấy, vi rút O3 tương đồng kháng nguyên và có khả năng kích thích sản sinh miễn dịch bảo hộ đối với vi rút týp
O lưu hành tại Việt Nam.
Ở một công bố mới đây, tác giả Trần Xuân Hạnh cho biết đánh giá hiệu quả phòng bệnh của vắc xin LMLM chỉ dựa vào giá trị tương đồng kháng nguyên là chưa thật sự chính xác (Trần Xuân Hạnh, 2020). Nên kết hợp giữa giá trị r1 và hiệu giá kháng thể trung hòa để đánh giá khả năng bảo hộ của vắc xin LMLM. Dựa vào căn cứ đó, có thể kết luận khả năng bảo hộ tốt của vắc xin LMLM chủng O3 không chỉ đối với các chủng thực địa trong cùng topotype (bảng 4.4) mà còn có khả năng bảo hộ chéo với topotype khác là SEA/ Mya98. Đối với topotype Cathay (chủng vi rút thích nghi gây bệnh trên lợn) thì khả năng bảo hộ của vắc xin LMLM vô hoạt chủng O3 cần tiếp tục được nghiên cứu.
4.5. ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH TẠO RA BỞI VẮC XIN LMLM CHỦNG O3
Từ kết quả của nội dung trước, chúng tôi xác định được nồng độ vi rút LMLM trước vô hoạt tối thiểu đạt 7 log TCID50/ml. Từ đó, cũng xác định được thời gian tiêm nhắc lại mũi 2 của vắc xin. Để có đánh giá toàn diện hơn về đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM nhũ dầu tại nồng độ đã chọn, nghiên cứu đã theo dõi độ dài miễn dịch trong thời gian khoảng 6 tháng sau khi tiêm mũi 2 (196 ngày sau tiêm mũi 1). Kết quả hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn được thể hiện trong bảng 4.6.
Bảng 4.6. Độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vắc xin LMLM bằng phương pháp trung hoà vi rút
Hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn đạt cực đại là 2,49 log10 tại thời điểm 56 ngày sau tiêm, kháng thể tiếp tục duy trì đến thời điểm 70 ngày sau tiêm. Từ ngày 70 sau tiêm trở đi, kháng thể bắt đầu có xu hướng giảm dần trong 2 tuần tiếp theo, hiệu giá đạt 2,46 log10. Các tuần tiếp theo, hiệu giá kháng thể vẫn duy trì trong ngưỡng bảo hộ (> 2, theo TCVN). Đến 196 ngày sau tiêm (khoảng gần 6 tháng sau tiêm mũi 2), hiệu giá kháng thể đạt xấp xỉ ngưỡng bảo hộ 2,01 log10. Lợn ở nhóm đối chứng không chuyển dương tính trong suốt thời gian theo dõi.
Kết quả theo dõi độ dài miễn dịch bằng phương pháp LPB-ELISA được thể hiện trong bảng 4.7.
Bảng 4.7. Độ dài miễn dịch ở lợn sau khi tiêm vắc xin LMLM bằng phương pháp LPB- ELSIA Ngày sau tiêm 56 70 84 98 112 126 140 154 168 182 196 Kết quả trong bảng 4.7 cho thấy, hiệu giá kháng thể của lợn khi xác định
bằng phương pháp ELISA tăng ổn định và tỉ lệ thuận với kết quả hiệu giá kháng thể trung hoà VNT. Kháng thể tại thời điểm 56 ngày sau tiêm mũi 1, hiệu giá đạt 2,52 log10. Kháng thể tiếp tục tăng trong hai lần lấy máu tại 70 và 84 ngày sau tiêm, kháng thể đạt cực đại là 2,61 log10. Sau đó, kháng thể có xu hướng giảm dần và duy trì ngưỡng bảo hộ (>2). Đến thời điểm 196 ngày sau tiêm (khoảng 6 tháng sau tiêm mũi 2), hiệu giá kháng thể chỉ còn 2,10 log10. Nhóm đối chứng không xác định được hiệu giá kháng thể trong thời gian theo dõi. Biểu đồ kháng thể trung hoà và kháng thể ELISA của lợn trong thời gian theo dõi được trình bày trong hình 4.12.
Hình 4.12. So sánh độ dài miễn dịch ở lợn sau tiêm vắc xin bằng phương pháp trung hòa vi rút và LPB-ELISA
Bên cạnh các biện pháp an toàn sinh học, tiêm vắc xin đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát sự bùng phát của bệnh LMLM bằng cách giảm các triệu chứng lâm sàng và mức độ lây truyền vi rút trong quần thể động vật nhạy cảm. Theo OIE, vắc xin LMLM vô hoạt thông thường được sử dụng để phòng bệnh có độ dài miễn dịch khoảng 4 tháng, vật nuôi được tiêm vắc xin này thường được tiêm lại 1-3 lần năm, tùy thuộc vào loài, tuổi thọ và giá trị kinh tế của nó; cũng như loại, chất lượng của vắc xin và tình hình dịch tễ học. Có một vài báo cáo về độ dài miễn dịch ở động vật nhai lại có thể kéo dài một năm hoặc nhiều hơn. Trong một nghiên cứu, gia súc được tiêm chủng ba lần với vắc xin nhũ dầu trong khoảng thời gian 6 tháng, đã có khả năng bảo hộ, không có triệu chứng lâm sàng khi được thử thách công cường độc sau 13 tháng kể từ ngày liều cuối cùng. Không có báo cáo về độ dài miễn dịch của lợn; tuy nhiên, với hai liều vắc xin dự phòng, cách nhau một tháng, được ước tính có khả năng bảo hộ trong khoảng 6 tháng dựa trên phản ứng huyết thanh học (Doel, 2003). Mặc dù phương pháp công cường độc được coi là phương pháp tiêu chuẩn trong việc đánh giá khả năng bảo hộ của động vật, tuy nhiên, do điều kiện cơ sở vật chất còn hạn chế và cũng liên quan đến các yếu tố kinh tế, dịch tễ nên trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp huyết thanh học. Theo Lê Trần Tiến (2017) cũng cho rằng, lợn được tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu đơn giá và nhị giá týp O
có độ dài miễn dịch kéo dài khoảng 6 tháng khi hiệu giá kháng thể được đánh giá bằng cả hai phương pháp trung hòa vi rút và phương pháp LPB- ELISA, kết quả này tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi. Vậy với kết quả thu được cho thấy, lợn sau khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu được sản xuất từ chủng O3 có độ dài miễn dịch khoảng 6 tháng. Đối với nhóm lợn giống (hậu bị, nái và đực giống) do thời gian nuôi dài nên đến thời điểm này cần được tiêm nhắc lại để duy trì đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng bảo hộ.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Về đặc tính di truyền: chủng vi rút O3 thuộc topotype ME-SA và khác biệt