Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5.4.Phương pháp lựa chọn động vật thí nghiệm
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4.Phương pháp lựa chọn động vật thí nghiệm
- Động vật thí nghiệm: lựa chọn lợn khoẻ mạnh, từ 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM.
- Để xác định động vật chưa tiêm vắc xin LMLM hoặc có bị nhiễm tự nhiên hay không sử dụng phương pháp ELISA: Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng protein phi cấu trúc từ hãng IDEXX: Foot and mouth disease (FMD) multispecies Antibody Test Kit code 06-41379-00.
- Các bước thực hiện:
Bước 1: Huyết thanh
Lấy lượng giếng phủ kháng nguyên tương đương với lượng mẫu cần kiểm tra ghi lại vị trí mẫu . Các giếng còn lại chưa sử dụng được bảo quản trong túi có zip chống ẩm bảo quản 2-80C.
Ủ mẫu trong thời gian ngắn:
Cho 90µl dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng. Cho 10µl đối chứng dương (PC) vào hai giếng Cho 10µl đối chứng âm (NC) vào hai giếng
Cho 10 µl vào các giếng chứa dung dịch pha loãng mẫu Sử dụng pipet đa kênh trộn đều 10 lần ở tất cả các giếng
Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (cho phép dao động 5 phút) Bước 2: Conjugate
Đĩa sau khi ủ 18 - 260C trong 60 phút với cách ủ thời gian ngắn và 18-260C trong 30 phút với cách ủ thời gian dài.
Gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa ủ.
Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl conjugate vào mỗi giếng
Với quy trình ủ trong thời gian ngắn: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (dao động 5 phút).
Với quy trình ủ trong thời gian qua đêm: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18- 260C trong 30 phút (dao động 5 phút).
Bước 3: Cơ chất
Đĩa sau khi ủ conjugate gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl TMB vào mỗi giếng
Ủ ở 18-260C trong 10 phút (dao động 1 phút)
Bước 4: Dừng phản ứng và đọc kết quả
Cho 100µl stop solution vào mỗi giếng
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA bước sóng 450nm (Chú ý nên đọc kết quả trong vòng 2 giờ sau khi dừng phản ứng)
Bước 5: Tính kết quả
Đối chứng: Đối chứng âm (Negative control: NC) Đối chứng dương (Positive Control: PC)
NCx= PCx =
Giá trị hợp lệ khi:
NCx ≤0.3 PCx ≤2.0 PCx-NCx≥0.3
Trong trường hợp kết quả giá trị đối chứng âm và đối chứng dương không hợp lệ thì cần phải làm lại thí nghiệm.
Mẫu:
S/P % = 100 x Sample A(450)-NCx) (PCx-NCx) Kết luận:
Đối với trâu bò, dê, cừu: S/P % < 35 là âm tính, S/P % ≥ 35 là dương tính Đối với lợn: S/P % < 55 là âm tính, S/P % ≥ 55 là dương tính