Vắc xin sống được sử dụng rộng rãi để ngăn ngừa hầu hết các bệnh do vi rút và các hoạt động nghiên cứu cho việc phát triển các vắc xin LMLM sống nhược độc cũng đang được tiến hành. Tuy nhiên hiện nay, tất cả các vắc xin LMLM được sử dụng trên toàn thế giới là vắc xin vô hoạt.
Năm 1927, với thành công bước đầu trong phòng thí nghiệm làm suy yếu vi rút, các nhà nghiên cứu đã tập trung phát triển vắc xin nhược độc. Năm 1950, Frenkel và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy vi rút LMLM trên môi trường tế bào biểu mô lưỡi sơ cấp và vô hoạt bằng formaldehyde. Tuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế như khả năng nuôi cấy trên tế bào sơ cấp thấp và vô hoạt bằng formaldehyde thường không hoàn toàn. Vào thập niên 60, các nhà khoa học đã sử dụng tế bào BHK dạng treo thay thế tế bào biểu mô lưỡi để nuôi cấy vi rút và sử dụng chất vô hoạt là ethylene imines thay cho formaldehyde (Rodriguez & Gay, 2011). Ngày nay, người ta sử dụng tế bào BHK để nuôi cấy vi rút và phương pháp của Frenkel được xem là nền tảng cho việc sản xuất vắc xin nhiều năm sau.
Ngày nay, đại đa số các vắc xin LMLM thương mại được sản xuất từ kháng nguyên tinh sạch vô hoạt là các protein cấu trúc phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu. Nhiều công thức vắc xin đã được chứng minh có hiệu quả trong việc phòng và khống chế dịch bệnh LMLM ở các nước Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi. Đối với vắc xin được sử dụng trong trường hợp khẩn cấp, do tính không ổn định của công
thức vắc xin, vắc xin thường được lưu trữ ở dạng đông lạnh kháng nguyên và tập trung thành ngân hàng vắc xin ở các quốc gia sạch bệnh. Ví dụ, khối liên kết Mỹ, Canada và Mexico có ‘‘ngân hàng vắc xin LMLM Bắc Mỹ’’. Công thức vắc xin bằng cách đông lạnh kháng nguyên gồm ít nhất 6PD50, có khả năng bảo hộ trong 4 – 7 ngày tiêm vắc xin sử dụng trên gia súc, lợn và cừu và kháng nguyên có khả năng bảo hộ toàn bộ các subtype trong một serotype (Golde & cs., 2005).
Vắc xin nhũ dầu thông thường chứa ít nhất 3PD50. Vắc xin làm giảm các triệu chứng lâm sàng và sự nhân rộng của vi rút nhưng không thể ngăn chặn sự hình thành quá trình lây nhiễm (lên đến 50%) của các chủng thực địa. Miễn dịch tạo bởi vắc xin nhũ dầu chỉ kéo dài khoảng 6 tháng, do đó, cần tiêm nhắc lại. Tuy nhiên, phản ứng miễn dịch sớm hay muộn tuỳ thuộc vào từng loài gia súc (ví dụ như: dê có đáp ứng miễn dịch muộn hơn so với bò) và ngưỡng bảo hộ ở các loài như: Cừu, dê hoặc trâu cũng khác nhau hoặc vẫn chưa có tiêu chuẩn cụ thể. Nhìn chung, khả năng bảo hộ đạt trên bê thì được xem như là đạt trên các loài khác (Oie, 2018). Hiệu quả sử dụng vắc xin nhũ dầu trên dê vượt trội hơn hẳn khi sử dụng vắc xin keo phèn.
Công thức vắc xin sử dụng Al(OH)3 – saponin có một số ưu điểm như: quá trình sản xuất đơn giản, kháng nguyên bám vào các hạt gel Al(OH)3. Tuy nhiên, vắc xin có các nhược điểm như: có thể gây sưng cục ở vị trí tiêm, hiệu quả không cao và độ dài miễn dịch ngắn hơn vắc xin nhũ dầu. Mặc dù vậy, trên thế giới, vắc xin vô hoạt keo phèn vẫn đang được sản xuất và sử dụng cho đa số động vật nhai lại (Doel, 2003; Valtulini & cs., 2005).
2.5.2. Một số thử nghiệm vắc xin mới
Về hướng nghiên cứu phát triển vắc xin LMLM, bên cạnh loại vắc xin truyền thống là vắc xin vô hoạt, đã có nhiều nghiên cứu phát triển vắc xin thế hệ mới phòng bệnh LMLM, có thể kể đến vắc xin tiểu phần (subunit vắc xin), vắc xin nhược độc, vắc xin vector tái tổ hợp, v.v... Mặc dù có ưu điểm là cho phép phân biệt giữa kháng thể do nhiễm tự nhiên và do tiêm vắc xin, độ dài miễn dịch kéo dài; các loại vắc xin thế hệ mới còn tồn tại nhược điểm như hiệu quả còn thấp và có nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp hoặc cường độc trở lại (Zhang & cs., 2011). Có thể thấy, tính đến thời điểm hiện tại, hướng sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh LMLM vẫn chưa thể thay thế được và vẫn là loại vắcxin duy nhất dùng để phòng bệnh LMLM trên thế giới.
2.5.3. Các vắc xin LMLM hiện hành
Một số vắc xin đang sử dụng trên thế giới: Hiện nay, có rất nhiều loại vắc xin được sử dụng do các công ty Merial, Intervet và Pfizer theo nguyên lý công nghệ như nhau. Nuôi vi rút LMLM trên tế bào BHK21 dạng treo và làm vô hoạt
vi rút bằng BEI, cô đặc và làm sạch kháng nguyên vi rút trước khi phối hợp với chất bổ trợ nhũ dầu kép hoặc keo phèn kết hợp với Saponin.
Các vắc xin có bổ trợ keo phèn đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh, trong khi đó vắc xin nhũ dầu kép gây đáp ứng miễn dịch tuy chậm hơn nhưng kéo dài. Vắc xin LMLM có thể chứa 1 serotype (O hoặc A hoặc C) hay nhiều serotype. Vắc xin đang dùng tại Việt Nam chứa các serotype O, A và Asia 1. Cục Thú y khuyến cáo sử dụng vắc xin LMLM chứa thành phần kháng nguyên có tương đồng (giá trị r1 ≥ 0,3) với các dòng vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam, cụ thể như sau: Đối với vắc xin LMLM đơn giá típ O, có một hoặc nhiều thành phần kháng nguyên trong số 5 thành phần kháng nguyên tương đồng (RAHO6/FMD/O-135, O 3039, O1 Manisa, O Taiwan/98, O TUR/5/2009, O1 (Campos) với các dòng vi rút týp O lưu hành tại Việt Nam. Một số vắc xin LMLM đang được cấp phép lưu hành tại Việt Nam: Vắc xin đơn giá týp O do công ty TNHH MTV Avac Việt Nam sản xuất, vắc xin nhập khẩu của Merial do Navetco và Vetvaco san chia, phối trộn và nhập khẩu. Ngoài ra còn vắc xin nhập khẩu của một số nước như: Nga, Trung Quốc, Argentina.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Đề tài được tiến hành từ tháng 8/2019 đến tháng 7/2020
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam
3.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU3.3.1. Chủng giống vi sinh, động vật thử nghiệm 3.3.1. Chủng giống vi sinh, động vật thử nghiệm
- Chủng sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng: chủng vi rút O/FMD/Avac3 là sản phẩm của đề tài nghiên cứu chọn chủng vi rút LMLM (báo cáo của công ty RTD kèm theo Công văn số 30.10/2016/BC-RTD).
- Chủng giống vi rút lựa chọn thuộc nhóm O/ME –SA/Panasia: O manisa, O/VN/ HN1/2013, O/VN/HT1/2015; nhóm O Cathay: O/VIT/9/2008; nhóm O /SEA-Mya98: O/VIT/5/2010; nhóm O/ME-SA/Ind2001: O/pig/Daklak/15. Thông tin một số chủng dùng làm phản ứng trung hoà chéo trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nguồn gốc các vi rút được chọn để đánh giá chọn giống
STT Tên chủng giống 1 O manisa 2 O/ VN/HN1/2013 3 O/VN/HT1/20 15 4 O/FMD/Avac3 5 O/pig/Daklak/1 5 6 O/VIT/9/2008 7 O/VIT/5/2010
Vi rút được chọn có thành phẩn kháng nguyên tương đồng với chủng vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam
Sơn Tây- Hà Nội Kỳ Anh- Hà Tĩnh Bảo Lộc –Lâm Đồng Đắk Lắk Tp. Hồ Chí Minh Hà Tĩnh
- Động vật thí nghiệm: lợn 4 - 5 tuần tuổi chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể kháng virus LMLM
- Tế bào BHK21 (Baby Hamster Kidney) dạng bám đáy.
3.3.2. Hóa chất
- Hóa chất và sính phẩm nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine serum), TV 1x (Trypsin versene), PBS (Phosphate Buffered Saline), Penicillin/ Streptomycin.
- Hóa chất dùng để vô hoạt, nhũ hóa: BEI (Binary Ethylenimine), Na2S2O3 (Sodium thiosulfate), ISA 201 VG, keo phèn nhôm Al(OH)3, Saponin.
- Môi trường kiểm tra vô trùng:TSB (Trypticase Soybean), TSA (trypticase soy agar), SD (sabouraud dextrose agar), XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), FTM (fruid thioglycolate), thạch máu.
- Hóa chất sử dụng cho phương pháp LPB - ELISA: theo bộ kít Liquid Phase Blocking ELISA (LPBE) for Detection FMDV Antibody Test Kit, Pirbright, UK bao gồm có: coating buffer, tween 20, skim milk, OPD (o- Phenylenediamine), TMB (Tetramethyl benzidine), citric acid, H2SO4, rabbit antiserum, guinea-pig antiserum, rabbit anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, huyết thanh đối chứng dương, huyết thanh đối chứng âm.
3.3.3. Trang thiết bị, dụng cụ
- Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3, nhà thử nghiệm động vật
- Phòng nuôi cấy tế bào, vi rút và các thiết bị an toàn sinh học khác: tủ ấm CO2, tủ lạnh 2 – 80 C, tủ âm 800 C, cân phân tích, máy đo pH, máy đọc ELISA, máy lắc, pipet điện, máy tạo nhũ, máy lọc tiếp tuyến.
- Dụng cụ: đầu típ các loại (10 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), đĩa ELISA, chai tế bào các loại: T25, T75, chai 10 tầng.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Giám định đặc tính di truyền của vi rút vắc xin
- Giải mã gen VP1
- Phân tích tương đồng trình tự gen và xây dựng cây phả hệ
3.4.2. Khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch của vắc xin LMLM chủng O3
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm một mũi vắc xin
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm hai mũi vắc xin
3.4.3. Ảnh hưởng của chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn
- So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng trung hòa và phản ứng LPB- ELISA
3.4.4. Khả năng bảo hộ chéo đối với chủng vi rút thực địa
- Mức tương đồng kháng nguyên với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA
- Mức tương đồng kháng nguyên với các topotype O lưu hành ở Việt Nam
3.4.5. Độ dài miễn dịch tạo ra bởi vắc xin LMLM chủng O3
- Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng trung hòa
- Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng LPB- ELISA
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút
Tế bào dòng được nuôi cấy trên môi trường DMEM, bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) như sau:
Khi tế bào BHK21 phát triển phủ kín đáy chai nuôi cấy (thường sau 48 giờ nuôi cấy). Sau đó, tách tế bào bằng Trypsin 1x. Khi tế bào co và bong ra, bổ sung DMEM 1x trung hòa trypsin, chuyển sang ống ly tâm, thu cặn tế bào. Hoàn nguyên tế bào bằng dung dịch DMEM 1x, đếm số tế bào và tính toán nồng độ ra chai tế bào.
Chuẩn độ vi rút và trung hòa tế bào theo quy trình dùng đĩa 96 giếng và 50000 tế bào/giếng. Phương pháp gây nhiễm tế bào: gây nhiễm vi rút để chuẩn bị sản xuất kháng nguyên trên chai 10 tầng. Gây nhiễm 20 ml giống vi rút cho chai 10 tầng, ủ 60 phút/ 370C/thêm môi trường duy trì DMEM, nuôi cấy trong tủ ấm 370 C có 5% C02. Theo dõi bệnh tích tế bào. Sau khi bệnh tích đạt trên 80% thì thu hoạch huyễn dịch. Thường thu hoạch kháng nguyên từ 18 – 24 giờ sau gây nhiễm.
3.5.2. Phương pháp chuẩn độ vi rút và trung hòa vi rút trên tế bào
3.5.2.1. Phương pháp chuẩn độ vi rút
Xác định chỉ số TCID50 (liều tại đó gây chết 50% giếng tế bào mà có CPE) bằng phương pháp chuẩn độ vi rút trên tế bào dạng treo, tính toán theo Spearman và Karber như sau: Log TCID50 = X0 - d/2 + d x ri/ni
Trong đó: X0: nồng độ pha loãng cao nhất mà tại đó tế bào có bệnh tích là 100%; d: khoảng cách pha loãng; ri: tổng giếng tế bào có bệnh tích từ nồng độ X0; ni: số giếng tế bào gây nhiễm ở mỗi nồng độ.
Vi rút LMLM được pha loãng theo cơ số 10 (từ 10-1 đến 10-8) trong môi trường DMEM. Trên đĩa 96 giếng, cho 100 µl huyễn dịch vi rút vào các giếng tương ứng. Cho 100 µl tế bào, lắc nhẹ, ủ đĩa và theo dõi trong 2 ngày. Đọc kết quả ghi số giếng có CPE, tính TCID50 theo công thức.
3.5.2.2. Phương pháp trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào (VNT)
Theo hướng dẫn của OIE (Oie, 2018) trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào sử dụng dung dịch tế bào BHK21 dạng treo. Quá trình thực hiện trên đĩa nuôi cấy 96 giếng, nồng độ tế bào là 50000 tế bào/giếng.
Vi rút LMLM O/FMD/Avac3 được pha loãng trong dung dịch DMEM, lấy nồng độ trung hòa là 100 TCID50/giếng. Huyết thanh 0, 28 và 56 ngày được diệt bổ thể ở 560C/30 phút; pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 từ 1/8 đến 1/512. Mỗi bậc pha loãng huyết thanh được lặp lại 2 lần (2 giếng). Vi rút trộn với huyết thanh theo tỷ lệ 1 : 1 (50 µl : 50 µl), ủ 370C/60 phút rồi thêm 50 µl tế bào đạt nồng độ 50000 tế bào/giếng vào, đem nuôi ở tủ ấm 370C /5% CO2. Theo dõi bệnh tích tế bào, sau 2 ngày đọc kết quả. Đọc kết quả theo hướng dẫn của OIE: dương tính (+): tế bào ở giếng phản ứng không bị phá hủy, âm tinh (-): tế bào ở giếng phản ứng bị phá hủy, bong khỏi đáy giếng, để lại khoảng trống. Hiệu giá trung hòa 50% được tính theo phương pháp Spearman-Karber: LogVNT50 = Xo + d/2 - d∑ri/ni
Trong đó: Xo là Log10 của nghịch đảo độ pha loãng huyết thanh cao nhất;
d:log10 của khoảng cách pha loãng; r: tổng số giếng dương tính; n: số giếng cho một độ pha loãng
Đọc kết quả: (i) âm tính nếu log10 VNT50 ≤ 1,21 (1/16); (ii) dương tính nếu log10 VNT50 ≥ 1,65 (1/45); (iii) nghi ngờ nếu log10 VNT50 trong khoảng 1,21 (1/16) đến 1,5 (1/32). Phản ứng thử được xem xét lặp lại nếu kết quả lặp lại cao hơn 1,21 (1/16) được xem là dương tính, ngược lại là âm tính.
Theo TCVN 8685 -10: 2014 (Tiêu Chuẩn Quốc Gia 8685, 2014) vắc xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút là 1/100 (khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên).
Đánh giá tính tương đồng kháng nguyên giữa các vi rút vắc xin và vi rút thực địa theo phương pháp tính tương quan r1 (Serological relationship: r1 – value). Công thức tính giá trị r1:
r1 = Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút vắc xin
Giá trị r1 ≥ 0,3 được xem như vi rút vắc xin có tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
Giá trị r1 < 0,3 được xem như vi rút vắc xin không tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
3.5.3. Phương pháp cô đặc, vô hoạt, phối trộn với chất bổ trợ và kiểm tra vắc xin khi phối trộn vắc xin khi phối trộn
3.5.3.1. Phương pháp vô hoạt vi rút bằng BEI
- Vi rút LMLM thu hoạch từ môi trường sau gây nhiễm trên tế bào BHK21 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng BEI (Binary ethylenimine) theo khuyến cáo của OIE như sau (Oie, 2018):
+ Vô hoạt vi rút tại nồng độ 1mM BEI /ml kháng nguyên trong 24 giờ tại
37 0C.
+ Sau 24 giờ vô hoạt, trung hòa lượng BEI tồn dư bằng dung dịch Na- thiosulphate (Na2S2O3) trong 2 giờ tại 370C.
+ Thu hoạch vi rút và kiểm tra vi rút sau vô hoạt bằng phương pháp nuôi cấy lại huyễn dịch vi rút sau vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21.
Kiểm tra vô hoạt vi rút: nuôi cấy và cấy chuyển 3 lần liên tiếp huyễn dịch vi rút đã vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21. Vi rút được đánh giá là vô hoạt đạt yêu cầu nếu sau 3 lần cấy chuyển liên tiếp, không thấy bệnh tích trên chai nuôi cấy tế bào BHK21 sau 3 ngày theo dõi. Quá trình thực hiện trên chai tế bào T25, lượng huyễn dịch vi rút gây nhiễm là 1ml.
3.5.3.2. Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ
Phương pháp nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép Montanide ISA 201VG (nhũ nước trong dầu trong nước) của hãng Seppic (Pháp)
-Kháng nguyên và nhũ dầu được trộn theo tỷ lệ 1 : 1
- Quá trình nhũ hóa được thực hiện trên máy nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị pha dầu khoáng ISA 201VG đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 50 - 100 vòng/phút trong khoảng 10 - 20 phút.
+ Bước 2: Chuẩn bị pha nước (kháng nguyên), chuyển từ từ kháng nguyên vào tank chứa pha dầu (theo tỷ lệ 1:1). Vừa chuyển kháng nguyên vừa tiếp tục khuấy trộn đến khi chuyển hết lượng kháng nguyên cần.