PHẦN 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.4. Kết quả giải trình tự và phân tích đột biến gen FAT1
Các sản phẩm PCR gồm 9 mẫu đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty 1st BASE tại Singapore. Tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự bằng phương pháp Sanger theo cả 2 chiều.
Mục đích của việc giải trình tự gene FAT1 là để xác định và so sánh trình tự gene của người liên quan đến phơi nhiễn dioxin với trình tự gene FAT1 đã được công bố trên ngân hàng gene xem liệu trên gene FAT1 của người có tiền sử phơi nhiễm dioxin có đột biến hay khơng và đột biến đấy có di truyền hay khơng.
Đặc trưng của phương pháp giải trình tự Sanger là tín hiệu trình tự sẽ thấp và khơng rõ ràng ở khoảng 10 nucleotide đầu các điểm trên đỉnh nucleotide có hiện tượng chồng chéo lên nhau, tín hiệu sẽ dần ổn định và rõ ràng ở những nucleotide tiếp theo sau đấy tín hiệu sẽ thấp dần ở một vài nucleotide cuối có thể giải thích do đoạn đầu và đoạn cuối phản ứng giải trình tự khơng ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ứng ổn định sẽ cho cường độ tín hiệu cao và chính xác. Kết quả giải trình tự 2 chiều được xử lý bằng các phần mềm Sequence Scanner V1.0 và Bioedit.
Trong số 9 mẫu được gửi đi giải trình tự, có 7 mẫu cho chất lượng tốt và 2 mẫu (D2 và E3) khơng đạt u cầu. Tín hiệu giải trình tự của các mẫu được kiểm tra lại bằng phần mềm Sequence Scanner V1.0. Kết quả phân tích của mẫu đại diện được trình bày trên hình 4.3.
A1-F
Hình 4.3: Kết quả phân tích chất lượng tín hiệu giải trình tự của một số mẫu đại diện
Chất lượng của tín hiệu giải trình tự được đánh giá bằng chỉ số giá trị chất lượng (Quality Value - QV) theo ba cấp độ.
Chất lượng giải trình tự thấp, QV khoảng 0-9 (màu đỏ);
Chất lượng giải trình tự trung bình, QV khoảng 20-30 (màu vàng);
Chất lượng giải trình tự cao, QV lớn hơn 30 (màu xanh lam).
Phần mềm Bioedit được sử dụng để cắt bỏ những nucleotide có tín hiệu kém. Sau đó, kết quả trình tự riêng biệt tạo ra bởi 2 mồi xuôi và ngược được ghép thành trình tự hồn chỉnh (consensus). Do ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật, chiều dài của trình tự hoàn chỉnh của 3 mẫu có sự biến thiên và được trình bày trong bảng 4.3. Mẫu E1 và E2 có chất lượng giải trình tự thấp hơn so với các mẫu cịn lại, vì vậy độ dài trình tự sau khi xử lý cũng ngắn hơn.
Bảng 4.3. Độ dài của các trình tự sau khi xử lý đảm bảo chất lượng.
Mẫu nghiên cứu A1 A2 A3 D1 D3 E1 E2
Chiều dài đoạn FAT1 hoàn
chỉnh thu được (bp) 696 697 697 697 676 592 606
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18], nucleotide tại vị trí 8798 được lấy từ trình tự gen tham chiếu của bản dựng (build) hg19. Tuy nhiên, hệ gen tham chiếu chỉ được xây dựng từ một vài cá thể tình nguyện cung cấp mẫu. Vì vậy, trong các nghiên cứu về SNP, việc xác định tần số alen là cần thiết. Bên cạnh
trình tự hệ gen tham chiếu, các bản ghi đơn lẻ khác cũng đóng vai trị quan trọng để hình dung về tần số alen trong cộng đồng.
Trong nghiên cứu này, tần số alen của vị trí nucleotide 8798 theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18] (tương ứng với vị trí 9178 trên hình 4.5) của những người bình thường khơng liên quan đến phơi nhiễm dioxin được xác định bằng cách sử dụng công cụ trực tuyến BLAST để tìm các trình tự tương đồng trên NCBI. Trình tự FAT1 hồn chỉnh của mẫu A1 có chiều dài 696 bp được sử dụng để tìm kiếm. Kết quả trên hình 4.4 cho thấy có 5 bản ghi FAT1 của người hiện đang được công bố trên ngân hàng gen. Các bản ghi này được thu thập để làm dữ liệu tham chiếu.
Hình 4.4: Kết quả BLAST sử dụng trình tự nucleotide mẫu A1. Có 5 bản ghi FAT1 của người không liên quan đến phơi nhiễm dioxin trên GenBank (năm bản ghi đầu của người không liên quan đến phơi nhiễm dioxin trên GenBank (năm bản ghi đầu
Trình tự gen FAT1 của 7 mẫu thuộc 3 gia đình có thế hệ thứ nhất là người ơng cựu chiến binh phơi nhiễm với dioxin được so sánh với các trình tự tham chiếu trên GenBank. Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 4.5.
Hình 4.5: Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen FAT1 của 7 người liên quan đến phơi nhiễm dioxin với 5 bản ghi tham chiếu trên Genbank.
NM_005245, NG_046994.1, XM_006714139.3, XM_005262834.3, XM_005262835.2: Năm trình tự tham chiếu trên GenBank. BNA1, BNA2, BNA3: Gia đình thứ nhất. BND1, BND3: Gia đình thứ 2. BNE1, BNE2: Gia đình thứ 3.
Kết quả trên hình 4.5 cho thấy vị trí 8798 trên cả 5 bản ghi tham chiếu đến từ những cá thể không liên quan tới phơi nhiễm dioxin đều là Adenosine. Trong khi đó, 5 cá thể có liên quan tới phơi nhiễm dioxin của nghiên cứu này thuộc 2 gia đình A và D cho kết quả Cytosine. Đáng lưu ý rằng gia đình D có người cháu biểu hiện trính trạng thiểu năng trí tuệ. Đáng tiếc rằng hai mẫu còn lại của gia đình E vì lý do kỹ thuật nên vị trí nucleotide 8798 khơng cịn nằm trong phạm vi có thể phân tích.
Tiếp theo, cần xác định đột biết A-C là đồng hợp hay dị hợp. Sơ đồ tín hiệu giải trình tự gốc được kiểm tra và kết quả được trình bày ở hình 4.6 và 4.7. Tại vị trí nucleotide thứ 8798, đồ thị tín hiệu của các mẫu thuộc gia đình A (hình 4.6) rõ ràng, đảm bảo độ tin cậy, trong khi đó tín hiệu của các mẫu thuộc gia đình D (hình 4.7) yếu hơn, độ tin cậy còn chưa thực sự đảm bảo. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy cả 5 mẫu đều là dị hợp tử C và A.
Hình 4.6. Kết quả phân tích di truyền đột biến trên sợi F của bệnh nhân và gia đình A
Hình 4.7: Kết quả phân tích di truyền đột biến trên sợi F và R của bệnh nhân và gia đình D
Đột biến thay thế A thành C ở vị trí 8798 trong DNA hệ gen của thu được trong nghiên cứu này tương đồng với kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18].Về mặt ý nghĩa sinh học, đột biến này xảy ra trong exon 10 dẫn đến việc thay thế Gln (Glutamine) thành Pro (Proline) tại vị trí 2933 trên protein FAT1. Kết quả của sự thay thế amino acid là hình thành một liên kết hydrogen xa với amino acid Asp2931, do đó dẫn tới thay đổi tính chất của protein sản phẩm (hình 2.5).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18] thực hiện trên 3 cá thể thuộc một gia đình hai thế hệ, vì vậy kết quả đột biến khơng loại trừ khả năng chỉ mang tính ngẫu nhiên. Dữ liệu nghiên cứu của chúng tơi được thực hiện trên gia đình D bao gồm 2 thế hệ, trong đó thế hệ thứ 3 bị thiểu năng trí tuệ, đã tìm thấy chính xác đột biến này. Như vậy, dữ liệu của chúng tôi là một bước tiếp theo để mở rộng hơn dung lượng mẫu cho nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18]. Nói cách khác, dữ liệu của chúng tôi đã cung cấp thêm bằng chứng về đột biến 8798.A=>C trong mối tương quan với bệnh thiểu năng trí tuệ gây ra bởi phơi nhiễm dioxin và di truyền qua các thế hệ.
Tuy nhiên, cần lưu ý rằng dữ liệu của gia đình A khơng có thành viên nào mang tình trạng thiểu năng trí tuệ nhưng cả 3 thế hệ đều mang đột biến dị hợp tử 8798.A=>C. Do đó, chúng tơi cho rằng không loại trừ khả năng đột biến này có tương quan với phơi nhiễm dioxin nói chung chứ khơng chỉ đặc hiệu riêng với bệnh nhân thiểu năng trí tuệ. Đồng thời, khơng loại trừ khả năng dioxin có một cơ chế tác động đặc hiệu tại vị trí nucleotide 8798 trên exon 10 của gen FAT1. Nói cách khác, nucleotide 8798 có thể là một điểm nóng (hot spot) trong cơ chế gây đột biến DNA của dioxin.