Sau khi chạy xong phản ứng PCR, kiểm tra sản phẩm bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -20OC
3.5.4. Giải trình tự Sanger
Các đột biến được xác định bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Phương pháp Sanger là phương pháp giải trình tự DNA dựa trên sự kết hợp có chọn lọc của
các dideoxynucleotide kết thúc chỗi bởi DNA polymerase trong quá trình sao chép DNA trong ống nghiệm.
Nguyên lý: Phương pháp này được thực hiện giống như phản ứng PCR thông
thường bao gồm các thành phần: DNA khuôn, mồi, dNTP, DNA polymerase, buffer, và nước. Điểm khác biệt là phương pháp này có bổ sung thêm một thành phần là các nucleotide biến đổi được gọi là dideoxyribonucleotide (ddNTPs) hay còn được gọi là các nuceotide kết thúc chuỗi. Các nucleotide này thiếu nhóm 3’- OH cần thiết cho sự hình thành liên kết photsphodiester giữa 2 nucleotide khiến DNA polymerase ngưng kéo dài chuỗi, do đó khi DNA polymerase kết hợp một ddNTP một cách ngẫu nhiên, quá trình kéo dài sẽ kết thúc.
Trong giải trình tự Sanger thông thường, mẫu DNA được chia thành 4 phản ứng riêng biệt và mỗi phản ứng được thêm vào 1 trong 4 loại (ddATP, ddGTP, ddCTP hoặc ddTTP). Trong giải trình tự Sanger tự động, tất cả các ddNTP được trộn trong một phản ứng duy nhất. Các ddNTP được dán nhãn phóng xạ hoặc huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu riêng biệt để phát hiện trong các máy giải trình tự.
Kết quả của PCR kết thúc chuỗi này là hàng triệu bản sao có độ dài ngẫu nhiên. Sau đó sản phẩm PCR được phân tách bằng cách điện di qua gel. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ xuất hiện dưới dạng các đỉnh và các màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser [30].
3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự DNA in silico
- Phân tích trình tự DNA in silico: Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích trên
phần mềm Sequence Scanner v1.0 và BioEdit 7.0 để phát hiện các đột biến khi so sánh với trình tự gen FAT1 tham chiếu được công bố trên ngân hàng gene NCBI thơng qua chương trình BLAST.
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Kết quả thu thập mẫu sinh phẩm của người có liên quan tới phơi nhiễm dioxin
Mục đích ban đầu của đề tài là phân tích đột biến gen FAT1 trên ba thế hệ bệnh nhân thiểu năng trí tuệ có liên quan đến phơi nhiễm dioxin. Việc lựa chọn các gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin tình nguyện tham gia nghiên cứu được thực hiện bởi Hội nạn nhân chất độc da cam Tỉnh Thái Nguyên. Trong danh sách 8 gia đình tình nguyện viên tham gia cung cấp mẫu thì chỉ có một gia đình (D) có người cháu (D1) có tình trạng thiểu năng trí tuệ.
Cơng tác thu thập mẫu là rất thách thức, vì vậy bên cạnh mục tiêu ban đầu, nhóm nghiên cứu đã đặt ra mục tiêu thứ hai nhằm khảo sát tính chất gây đột biến DNA trên người bị phơi nhiễm dioxin và sự di truyền của đột biến qua 3 thế hệ. Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy dioxin có ảnh hưởng lên tồn bộ hệ gene [31] vì vậy có thể sẽ xuất hiện các đột biến tại các vị trí khác nhau trên hệ gene người.
Một hạn chế trong khâu thu thập mẫu là những gia đình ba thế hệ cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin cần có đối chứng là mẫu của người bà và người mẹ không liên quan tới dioxin. Tuy nhiên, do một số nguyên nhân mà nhóm nghiên cứu chưa tiếp cận được với những người này.
Bảng 4.1: Danh sách các gia đình 3 thế hệ liên quan đến phơi nhiễm dioxin tình nguyện tham gia nghiên cứu
STT
Thế hệ thứ ba (cháu của cựu chiến binh có biểu hiện dị tật bất thường)
Thế hệ thứ nhất (cựu chiến binh bị phơi nhiễm dioxin
Thế hệ thứ hai (con của cựu chiến binh) Kí
hiệu Năm sinh Tình trạng dị tật Kí hiệu Kí hiệu
1 A1 10/5/2002 Khơng có bàn tay trái A2 A3
2 B1 Lép, khơng có ngực B2 B3
3 C1 26/12/2007 6 ngón C2 C3
4 D1 12/10/2008 Bại liệt, không phát triển D2 D3
5 E1 24/7/1997 Điếc E2 E3
6 G1 9/6/2010 Nhiễm khuẩn máu G2 G3
7 H1 22/11/2011 H2 E2
4.2. Kết quả tách chiết DNA
Mẫu máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin được tách chiết DNA tổng số bằng bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất Favor Prep. Kết quả tách chiết DNA tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose và trình bày trên hình 4.1.