PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số sẽ được tách chiết từ máu toàn phần của bệnh nhân thiểu năng trí tuệ có liên quan đến phơi nhiễm dioxin và gia đình bằng phương pháp sử dụng bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit. DNA sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Nên tiến hành tách chiết DNA ngay sau khi thu nhận, thời gian tối thiếu là 1 tuần để hiệu quả tách chiết DNA là cao nhất.
Bảng 3.4. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu của người liên quan đến dioxin bằng bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit
(Theo hướng dẫn của nhà sản xuất Favor Prep)
Bước 1 Chuyển 200 µl mẫu máu tồn phần vào ống li tâm siêu nhỏ
Bước 2 Nếu cần loại bỏ RNA => bổ sung 4 µl Rnase A 100mg/ml (không được cung cấp trong bộ kit)
Bước 3
Bổ sung 20 µl Proteinase K
Bổ sung 200 µl FATG2 Buffer (đếm)
Votex, ủ ở 60 độ trong 30p, thi thoảng votex Bước 4 Ủ ở 70OC trong 10 phút
Bước 5 Add 200 µl ethanol (96% or 100%). Votex (hơi kĩ)
Bước 6 Spindown để những giọt dụng dịch cịn dính bên thành ống dồn hết xuống đáy.
Bước 7
Đặt cột mini FATG vào trong ống eppendorf mới, chuyển hỗn hợp ở ống cũ ( bao gồm cả tủa) cẩn thận sang cột mini FATG. Ly tâm ở tốc độ 13000v/p trong 1 phút. Sau đó đặt cột mini FATG sang ống eppendorf mới (loại bỏ hết phần dịch)
Bước 8
Thêm 400µl W1 buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch.
(Đảm bảo rằng ethanol đã được thêm vào W1 Buffer khi mở ra lần đầu)
Bước 9
Bổ sung 750µl WASH Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút. Sau đó loại bỏ dịch.
(Đảm bảo rằng ethanol đã được thêm vào WASH Buffer khi mở ra lần đầu)
Bước 10 Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút, làm khô cột
Bước 11
Thêm 100µl Elution Buffer vào ống 1, thêm 50µl Elution Buffer vào ống 2 (hoặc nước có PH 7,5-9) vào màng của cột mini FATG ( đặt sang ống eppendorf mới) .
Để đứng cột trong 3p, DNA từ màng sẽ rơi xuống ống ( lưu ý khi nhỏ Elution Buffer cần nhỏ chính xác vào màng).
Bước 12 Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 2 phút để rửa giải DNA
Bước 13 Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose 0,8% Bước 14 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20OC
Phương pháp điện di kiểm tra chất lượng DNA
Kiểm tra kích thước và độ nguyên vẹn của DNA bằng phương pháp điện di trên gel Agarose
Bước 1: Đun gel 0,8% để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 70OC Bc 2: Đổ gel vào khn có cài sẵn răng lược
Bước 3: Đợi cho gel đông lại, nhấc lược ra, tháo khuôn và thả gel vào bể điện di. Bước 4: Bổ sung dung dịch TAE1x vào bể điện di.
Bước 5: Tra mẫu. Mix 0,5µl Midori Green Direct + 5µl mẫu DNA cần kiểm tra. Bước 6: Tiến hành chạy điện di ở 110V trong 30p.
Bước 7: Đặt gel lên máy soi gel để quan sát các băng DNA, chụp ảnh lưu trữ dữ liệu. (Midori Green Direct có tác dụng nhuộm giúp DNA phát huỳnh quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại giúp quan sát được các băng vạch DNA).
Bước 8: Đánh giá chất lượng kích thước, nồng độ DNA dựa vào ladder.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA từ máu của người có liên quan đến phơi nhiễm dioxin
Phương pháp Sử dụng bộ KIT để tách chiết DNA
Số lượng mẫu 24 mẫu máu