L: Ladder 1kb của hãng Thermo Siencetific
Đường chạy từ 1 → 9 : Sản phẩm PCR đoạn gen FAT1
Lượng mẫu nạp trên mỗi làn trên bản điện di là 5 uL/mỗi làn.
Kết quả điện di sản phẩm cho PCR ở hình 4.2 cho thấy tại các đường chạy xuất hiện băng sáng, không đứt gãy tuy nhiên vẫn có băng mờ phía dưới có thể là mồi thừa, primer dimers hay các sản phẩm phụ không mong muốn khác. Đối chiếu với thang chuẩn DNA kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước dự đốn theo lý thuyết ≈700bp. Như vậy có thể tạm thời kết luận PCR đã khuếch đại thành công gen FAT1 từ mẫu máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin.
4.4. Kết quả giải trình tự và phân tích đột biến gen FAT1
Các sản phẩm PCR gồm 9 mẫu đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty 1st BASE tại Singapore. Tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự bằng phương pháp Sanger theo cả 2 chiều.
Mục đích của việc giải trình tự gene FAT1 là để xác định và so sánh trình tự gene của người liên quan đến phơi nhiễn dioxin với trình tự gene FAT1 đã được công bố trên ngân hàng gene xem liệu trên gene FAT1 của người có tiền sử phơi nhiễm dioxin có đột biến hay khơng và đột biến đấy có di truyền hay khơng.
Đặc trưng của phương pháp giải trình tự Sanger là tín hiệu trình tự sẽ thấp và khơng rõ ràng ở khoảng 10 nucleotide đầu các điểm trên đỉnh nucleotide có hiện tượng chồng chéo lên nhau, tín hiệu sẽ dần ổn định và rõ ràng ở những nucleotide tiếp theo sau đấy tín hiệu sẽ thấp dần ở một vài nucleotide cuối có thể giải thích do đoạn đầu và đoạn cuối phản ứng giải trình tự khơng ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ứng ổn định sẽ cho cường độ tín hiệu cao và chính xác. Kết quả giải trình tự 2 chiều được xử lý bằng các phần mềm Sequence Scanner V1.0 và Bioedit.
Trong số 9 mẫu được gửi đi giải trình tự, có 7 mẫu cho chất lượng tốt và 2 mẫu (D2 và E3) khơng đạt u cầu. Tín hiệu giải trình tự của các mẫu được kiểm tra lại bằng phần mềm Sequence Scanner V1.0. Kết quả phân tích của mẫu đại diện được trình bày trên hình 4.3.
A1-F
Hình 4.3: Kết quả phân tích chất lượng tín hiệu giải trình tự của một số mẫu đại diện
Chất lượng của tín hiệu giải trình tự được đánh giá bằng chỉ số giá trị chất lượng (Quality Value - QV) theo ba cấp độ.
Chất lượng giải trình tự thấp, QV khoảng 0-9 (màu đỏ);
Chất lượng giải trình tự trung bình, QV khoảng 20-30 (màu vàng);
Chất lượng giải trình tự cao, QV lớn hơn 30 (màu xanh lam).
Phần mềm Bioedit được sử dụng để cắt bỏ những nucleotide có tín hiệu kém. Sau đó, kết quả trình tự riêng biệt tạo ra bởi 2 mồi xi và ngược được ghép thành trình tự hồn chỉnh (consensus). Do ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật, chiều dài của trình tự hồn chỉnh của 3 mẫu có sự biến thiên và được trình bày trong bảng 4.3. Mẫu E1 và E2 có chất lượng giải trình tự thấp hơn so với các mẫu cịn lại, vì vậy độ dài trình tự sau khi xử lý cũng ngắn hơn.
Bảng 4.3. Độ dài của các trình tự sau khi xử lý đảm bảo chất lượng.
Mẫu nghiên cứu A1 A2 A3 D1 D3 E1 E2
Chiều dài đoạn FAT1 hoàn
chỉnh thu được (bp) 696 697 697 697 676 592 606
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18], nucleotide tại vị trí 8798 được lấy từ trình tự gen tham chiếu của bản dựng (build) hg19. Tuy nhiên, hệ gen tham chiếu chỉ được xây dựng từ một vài cá thể tình nguyện cung cấp mẫu. Vì vậy, trong các nghiên cứu về SNP, việc xác định tần số alen là cần thiết. Bên cạnh
trình tự hệ gen tham chiếu, các bản ghi đơn lẻ khác cũng đóng vai trị quan trọng để hình dung về tần số alen trong cộng đồng.
Trong nghiên cứu này, tần số alen của vị trí nucleotide 8798 theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18] (tương ứng với vị trí 9178 trên hình 4.5) của những người bình thường khơng liên quan đến phơi nhiễm dioxin được xác định bằng cách sử dụng công cụ trực tuyến BLAST để tìm các trình tự tương đồng trên NCBI. Trình tự FAT1 hồn chỉnh của mẫu A1 có chiều dài 696 bp được sử dụng để tìm kiếm. Kết quả trên hình 4.4 cho thấy có 5 bản ghi FAT1 của người hiện đang được công bố trên ngân hàng gen. Các bản ghi này được thu thập để làm dữ liệu tham chiếu.