PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR khuếch đại gen FAT1 từ DNA đã được tách chiết từ mẫu máu với cặp mồi đặc hiệu.
a. Tìm ra điều kiện tối ưu để khuyếch đại đoạn gen FAT1
Sử dụng cặp mồi FAT-F và FAT-R để nhân đoạn gen 696 nucleotide trên exon 10 của gen FAT1. Đoạn gen có chiều dài 696 nucleotide được nhân lên sử dụng cặp mồi:
FAT-F: 5ʹ-CGTGCCTATTGGAACAGAGATAG-3ʹ FAT-R: 5ʹ-GAATCAGCATCCGTGGTACTT-3ʹ
Nhận thấy sự khó khăn trong việc PCR khuyếch đại đoạn gen FAT1 của người, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm PCR với dải nhiệt độ gắn mồi là 40, 45, 50, 55, 57, 60 để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng.
Thí nghiệm 1: Thời gian kéo dài chuỗi
Nhóm nghiên cứu đã tối ưu thời gian kéo dài chuỗi để phù hợp với chiều dài đoạn gen FAT1 là 696 bp. Theo lý thuyết trung bình 60s sẽ tổng hợp được 1 kb => đoạn gen FAT1 có chiều dài ≈ 700 bp sẽ cần ≈ 42s. Thực tế tiến hành chạy 45s.
Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ DNA khuôn
DNA tổng số được tách từ máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ -20OC. Nhưng với thời gian lưu trữ lâu và trong quá trình thử nghiệm tìm điều kiện tối ưu phản ứng PCR thì DNA bị rã đông nhiều lần sẽ suy thối gây khó khăn trong quá trình PCR. Vì vậy, với chất lượng DNA khác nhau của từng mẫu nhóm nghiên cứu đã tiến hành tối ưu nồng độ DNA tổng số dùng làm khn cho từng phản ứng PCR (có thể khơng pha lỗng hoặc pha lỗng 10 lần)
Thí nghiệm 3: Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Sử dụng công cụ trực tuyến Oligo Calculator
Tên mồi Trình tự Tm
FAT-F 5ʹ-CGTGCCTATTGGAACAGAGATAG-3ʹ 55,3OC
FAT-R 5ʹ-GAATCAGCATCCGTGGTACTT-3ʹ 52,4OC
Ta ≈ 51OC
Bước gắn mồi được thử nghiệm với dải nhiệt độ như trên hình 6.
b. Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR Hoá chất Thể tích (1 phản ứng 15µl) Thể tích (1 phản ứng 45µl) DNA templete 1 3 Primer F 0.6 5.4 Primer R 0.6 5.4 Tag 0.1 0.9 Buffer 10mX 1.5 13.5 dNTP 10mM 0.3 2.7 H2O 10.9 98.1 Tổng thể tích 15µl 45µl
Trộn đều hỗn hợp sau đó chuyển vào máy PCR, nhiệt độ gắn mồi được tối ưu hoá ở 55OC trong 45 giây. Phản ứng diễn ra trong 35 chu kì. Chu trình nhiệt của phản ứng được thiết lập như sau:
Hình 3.2: Chu trình nhiệt tối ưu của phản ứng PCR khuyếch đại gene FAT1
Sau khi chạy xong phản ứng PCR, kiểm tra sản phẩm bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -20OC