3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và Phòng khám thú y cộng đồng - Khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ 10/2017 đến 10/2018.
3.3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU3.3.1.Đối tượng 3.3.1.Đối tượng
Chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirustype 2mang đến khám và điều trị tại Phòng khám thú y cộng đồng.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
* Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA:
- Proteinase K, PBS 1x (phosphate buffered saline); - Ethanol 70% (Merk).
* Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR và chạy điện di: - Go taq Green;
- TBE (tris-Borate-EDTA), Agarose (bột), Redsafe. - Marker (Invitrogen)
* Hóa chất dùng trong làm tiêu bản bệnh lý: Formol 10%, xylen, cồn tuyệt đối 1000, paraffin, cồn 900, thuốc nhuộm Hematoxylin, cồn 700, thuốc nhuộm Eosin, nước cất,...
3.3.3. Trang thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Biohazard safety Cabinet); - Pipette 10µl, 20µl, 200µ, 1000µl;
- Đầu côn tương ứng 10µl, 20µl, 200µl, 1000µl;
- Eppendorf tube 1,5ml, 500µl, 200µ, ống ly tâm 15ml; - Khay đựng ống Eppendorf, găng tay, bông cồn, cân…; - Nồi hấp nhiệt tiệt trùng;
- Các loại tủ lạnh 40C, -200C, -800C; - Máy chạy PCR: Sytem 9700 (GeneAmp);
- Máy điện di Wide Mini-Sub Cell BT (BIO-RAD); - Máy đọc và chụp ảnh gel;
- Máy ly tâm bản Eppendorf; - Máy votex;
- Máy đúc tiêu bản, khuôn đúc tiêu bản, máy cắt tiêu bản, bể nước ấm; - Lamen;
- Tủ ấm.
- Dao, kéo, pank kẹp, lọ đựng mẫu, phiến kính, la men, găng tay, khẩu trang, bông cồn…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu tình hình chó mắc viêm ruột tiêu chảy do Parvovirustype 2
-Tình hình mắc bệnh ở chó được mang đến khám và điều trị tại Phòng khám thú y cộng đồng.
-Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus type 2 theo nhóm giống; -Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus type 2 theo lứa tuổi; - Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu do Parvovirus type 2 ở chó đã được tiêm phòng và chó chưa được tiêm phòng.
3.4.2. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do
Parvovirustype 2
-Xác định triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh do Parvovirustype 2;
-Xác định tổn thương đại thể ở chó mắc bệnh do Parvovirustype 2;
-Xác định tổn thương vi thể ở chó mắc bệnh do Parvovirus type 2.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lâm sàng, ghi chép, mô tả
Đối với chó mang đến khám và điều trị tại phòng khám, nếu có dấu hiệu nghi ngờ mắc viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus type 2 sẽ được kiểm tra bằng cách lấy phân, chất chứa trong trực tràng làm xét nghiệm nhanh bằng test thử CPV (Canine Parvovirus – Step Test Kit).
- Trường hợp dương tính với Parvovirus type 2 sẽ tiến hành khám và ghi chép thông tin, số liệu. Chú ý các biểu hiện: sốt, tiêu chảy, nôn mửa, ủ rũ, ăn ít hoặc bỏ ăn, màu sắc niêm mạc, độ đàn tính của da và tình trạng của phân.
Phương pháp test nhanh.
+ Đặc tính:
- Kết quả xét nghiệm nhanh trong vòng 5 – 10 phút; - Không cần sử dụng thiết bị đắt tiền;
- Dễ dự trữ và bảo quản;
- Các nguyên liệu xét nghiệm có độ tinh khiết và chất lượng cao, làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của thiết bị.
+ Vật liệu:10 test/ hộp
- Thiết bị xét nghiệm 10 đơn vị;
- Chất pha loãng (dung dịch đệm) 1ml x 10 đơn vị;
- Ống nhỏ giọt 10 đơn vị;
- Que lấy bệnh phẩm 10 đơn vị.
+ Thành phần:
Thiết bị xét nghiệm có đánh dấu vùng S (vị trí nhỏ giọt), vạch kết quả xét nghiệm T và vạch chứng C. Thiết bị này gồm các thành phần như chất đệm mẫu, chất đệm, màng nitơ – cellulose (giấy xét nghiệm) và chất đệm hấp thu.
+ Tác dụng:Phát hiện kháng nguyên Parvovirus type 2 trên chó từ các mẫu phân. + Cách sử dụng:
- Mẫu xét nghiệm: Phân của chó nghi mắc Parvovirus type 2
- Cách bảo quản mẫu bệnh phẩm: Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8°C trong 24h; Giữ ở nhiệt độ 22 – 25°C trước khi thực hiện. - Thao tác xét nghiệm:
+ Lấy mẫu phân bằng một que lấy bệnh phẩm và đưa que vào lọ chứa 1ml chất pha loãng;
+ Khuấy động xoay tròn que trong chất pha loãng; + Lấy mẫu phân pha loãng với 1 ống nhỏ giọt;
+ Nhỏ 3 – 4 giọt mẫu vào vùng S của thiết bị xét nghiệm; + Chờ 5 – 10 phút đọc kết quả, kết quả âm tính xét sau 10 phút. - Giải thích kết quả xét nghiệm:
Vệt màu đỏ tía sẽ xuất hiện trên vạch đối chứng C không liên quan đến kết quả. Sự hiện diện của vệt khác trên vạch mẫu T xác định kết quả xét nghiệm.
Vạch đối chứng C: vạch này sẽ luôn luôn xuất hiện bất kể có sự hiện diện hay không của kháng nguyên Parvovirus type 2. Nếu vạch này không xuất hiện, test xem như không có giá trị, có thể do pha loãng không tinh khiết và thiết mẫu xét nghiệm. Cần làm lại với chất pha mới.
Vạch mẫu T: xác định sự hiện diện của kháng nguyên Parvovirus type 2. - Âm tính: chỉ xuất hiện vạch đối chứng C;
- Dương tính: xuất hiện cả vạch mẫu T và vạch đối chứng C. - Làm lại xét nghiệm khi:
+ Cả hai vạch mẫu T và vạch đối chứng C đều không xuất hiện; + Chỉ có vạch mẫu T xuất hiện.
Hình 3.1. Test thử CPV
(Canine Parvovirus One-step Test Kit).
3.5.2.Phương pháp mổ khám quan sát đại thể
Thường sử dụng phương pháp mổ khám toàn diện. Mổ khám chó quan sát các tổn thương đại thể và tiến hành chụp ảnh các tổn thương điển hình.
Bao gồm các bước sau:
Bước 1: Đặt chó nằm trên bàn mổ hoặc tấm ván hay túi nilon đã chuẩn bị trước, dùng dao cắt da và các cơ trong nách tới khớp xương bả vai và kéo dài đến cằm hai bên, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho chó nằm tư thế nằm ngửa.
Bước 2: Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng để bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
Bước 3: Quan sát dịch chứa trong xoang ngực và xoang bụng, kiểm tra những biến đổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kích thước và hình dáng.
Bước 4: Cắt tách lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cùng cắt đứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành. Kéo toàn bộ hệ thống dạ ày ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn các tổ chức khác. Lấy các tổ chức trong cổ, xoang ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
Bước 5: Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim.
Bước 6: Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khí quản,phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và độ đàn hồi.
Bước 7: Rạch kiểm tra chất chứa bên trong thực quản, gạt bỏ chất chứa kiểm tra niệm mạc.
Bước 8: Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra về màu sắc, kích thước, độ cứng mềm, ký sinh trùng, các ổ viêm, hoại tử, ổ áp xe. Rạch bổ gan, lách kiểm tra có bị sưng và tách túi mật kiểm tra niêm mạc.
Bước 9: Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ đôi kiểm tra bên trong thận, kiểm tra bóng đái.
Bước 10: Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba trong cơ thể về màu sắc, kích thước, độ đàn hồi, bổ đôi kiểm tra bên trong có biểu hiện sưng hay không.
Bước 11: Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày đến hậu môn loại bỏ chất chứa và quan sát bề mặt niêm mạc đặc biệt chú ý tới: chất chứa, dịch, màu sắc, điểm hoại tử, xuất huyết.
3.5.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) + Tách chiết DNA + Tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng Kit Qiagen (Dneasy Blood&Tisue Kit-69506.250).
Quy trình tách chiết DNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit, các bước thực hiện như sau:
Xử lý mẫu:
Mẫu bệnh phẩm là mẫu phân, dịch ruột hoặc mẫu nội tạng (ruột, gan, thận, hạch, lách…).
Lấy một lượng mẫu bệnh phẩm tương ứng có khối lượng ≤ 100mg bằng dao và kéo vô trùng vào trong cối sứ. Cắt nhỏ bệnh phẩm bằng kéo và dao. Dùng chày sứ nghiền nhỏ bệnh phẩm cho đến khi thành dạng mịn đồng nhất.
Các bước tách chiết bao gồm:
Bước 1: Chuyển mẫu đã xử lý vào ống eppendorf. Bổ sung 180µl buffer ATL.
Bước 2: Bổ sung 20µl Proteinase K vào ống eppendorf trên, trộn đều ủ ở 560C cho đến khi phân giải hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 200 µl đệm Buffer AL vào ống, trộn đều bằng vortex trong 15 giây, thêm 200µl ethanol (100%), trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 5: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1
không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 6: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2
và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới và giữ lại cột.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới. Thêm 100 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ ống eppendorf.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
+ Phản ứng PCR:
Chuẩn bị các thành phẩn Master mix theo bảng sau:
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
Go taq Green 12,5 Nước tinh khiết 6,5
Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5
DNA mẫu 5
Tổng thể tích 25
Chúng tôi sử dụng cặp mồi cho sản phẩm PCR có kích thước 550bp, có trình tự nucleotide như sau:
Bảng 3.2.Thông tin cặp mồi định tính được sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)
Kích thước sản phẩm
(bp) Tác giả
Mồi xuôi AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA
550
Seon Ah Park et al
2012
Mồi ngược TTCTGACAGCAGGTTGACCA
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của sản phẩm PCR sử dụng
Hoạt động Nhiệt độ Thời Gian Chu kì
Biến tính 950C 2 phút 1 Biến tính 950C 30 giây
40 Gắn mồi 550C 30 giây
Kéo dài 720C 60 giây
Hoàn thành 720C 5 phút 1 Giữ sản phẩm 40C ∞
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1,2%.
• Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Redsafe trong khoảng 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.5.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm: Quy trình chuyển đúc mẫu:
Bước 1: Lấy mẫu và cố định
Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy vào trong formol 10% trung tính trong ít nhất 24-48h ở nhiệt độ thường, yêu cầu mẫu bệnh phẩm cần được ngâm ngập trong dung dịch formol và thể tích dung dịch phải gấp dung tích mẫu từ 5-10lần. (chú ý: nếu lọ đựng mẫu nhỏ phải cắt mẫu nhỏ để dung dịch có thể thẩm thấu hết vào trong tổ chức mô bệnh phẩm).
Mẫu sau khi ngâm trong formol 10% từ 24-48h thì có thể cắt chuyển đúc. Cắt mẫu sao cho kích cỡ và hình dáng của mẫu vừa với cassettes.
Bước 3: Chuyển mẫu
Rửa nước: Dưới vòi nước máy, ngâm các cassettes mẫu trong bình nước máy để dưới vòi nước máy chảy trong 30 phút.
Để ngâm trong bình nước cất: chuyển mẫu sang bình nước cất ngâm 30 phút Chuyển ngâm cồn (quy trình bắt đầu từ 10h sáng). Mục đích để đẩy nước ra khỏi mô bào.
Mẫu lấy ra khỏi nước được thấm khô bằng giấy vệ sinh rồi được chuyển lần lượt qua:
Cồn 1: 800/1h, Cồn 2: 900/1h, Cồn 3: 950/2h, Cồn 4 : 950/2h, Cồn 5: 1000/13h;
Cồn 6 : 1000/1h, Cồn 7: 1000/1h, Cồn 8: 1000/1h;
Chuyển ngâm xylen. Mục đích để đẩy cồn ra khỏi mô bào.
Mẫu lấy ra khỏi cồn được thấm khô bằng giấy vệ sinh rồi được chuyển lần lượt qua:
Xylen 1: 1h, Xylen 2: 1h, Xylen 3: 1h;
Chuyển ngâm paraffin. Mục đích để thay thể và đẩy xylen ra khỏi mô bào. Mẫu lấy ra khỏi xylen thấm khô và cho vào lần lượt:
Paraffin 1 : 2h. Sau đó qua paraffin 2: 2h
Bước 4: Đúc mẫu
Chuẩn bị dụng cụ, khuôn mẫu, paraffin. Khi đổ paraffin phải nóng cảy hoàn toàn nhưng nhiệt độ không vượt quá 560C tránh làm khô mẫu.
Cắt và dán mẫu: cắt block bằng máy Microctocom với độ dày 2 - 3µm sao cho mảnh cắt không rách, nát phần mô bào là được, cho vào nước để giãn bệnh phẩm rồi cho vào bể nước ấm 450C. Sau khi bệnh phẩm giãn dùng lam kính vớt bệnh phẩm, để tủ ấm 370C.
Quy trình nhuộm tiêu bản
Tiêu bản sau khi cắt để tủ ấm 370C ít nhất 2h đem đi nhuộm.
Ngâm giỏ tiêu bản lần lượt qua:Xylen 1: 5 phút, Xylen 2: 5 phút, Xylen 3: 5 phút
Bước 2: Khử xylen
Ngâm giỏ tiêu bản lần lượt qua các cốc cồn:
Cồn 1000: 5 phút, Cồn 1000: 5 phút, Cồn 900: 5 phút, Cồn 700: 5 phút
Bước 3: Khử cồn
Rửa nước thường: 5 phút. Ngâm nước cất: 5 phút
Lau khô từng tiêu bản, xếp ngửa lên giá chuẩn bị nhuộm.
Bước 4: Nhuộm Hematoxylin
Thời gian: 12 phút. Rửa nước thường: 3 phút. Ngâm nước cất: 3 phút
Bước 5: Nhuộm Eosin
Thời gian: 5 phút. Rửa nước thường: 2 – 3 phút. Ngâm nước cất: 2 phút
Bước 6: Đẩy nước, nhúng tiêu bản nhiều lần qua các cốc cồn sau nhuộm: Cồn 1: 900/5 phút, Cồn 2: 1000/5 phút, Cồn 3: 1000/5 phút
Bước 7:Khử cồn, nhúng tiêu bản qua các cốc xylen sau nhuộm: Xylen 1: 5 phút, Xylen 2: 5 phút
Bước 8: Gắn lamen
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản (chú y tránh tạo bọt khi gắn lamen), sau đó ghi nhãn lên tiêu bản.
3.5.5. Phương pháp sử lý số liệu
Các số liệu thu thập từ Phòng khám thú y Cộng Đồng được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel 2010.
Xác định các chỉ tiêu theo dõi:
Tổng số con chết
Tỷ lệ chết (%) = x 100 Tổng số con theo dõi
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH MẮC CÁC LOẠI BỆNH Ở CHÓ TẠI PHÒNG KHÁM 4.1.1. Phân loại nhóm bệnh của chó mang đến khám và điều trị