+ Tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng Kit Qiagen (Dneasy Blood&Tisue Kit-69506.250).
Quy trình tách chiết DNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit, các bước thực hiện như sau:
Xử lý mẫu:
Mẫu bệnh phẩm là mẫu phân, dịch ruột hoặc mẫu nội tạng (ruột, gan, thận, hạch, lách…).
Lấy một lượng mẫu bệnh phẩm tương ứng có khối lượng ≤ 100mg bằng dao và kéo vô trùng vào trong cối sứ. Cắt nhỏ bệnh phẩm bằng kéo và dao. Dùng chày sứ nghiền nhỏ bệnh phẩm cho đến khi thành dạng mịn đồng nhất.
Các bước tách chiết bao gồm:
Bước 1: Chuyển mẫu đã xử lý vào ống eppendorf. Bổ sung 180µl buffer ATL.
Bước 2: Bổ sung 20µl Proteinase K vào ống eppendorf trên, trộn đều ủ ở 560C cho đến khi phân giải hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 200 µl đệm Buffer AL vào ống, trộn đều bằng vortex trong 15 giây, thêm 200µl ethanol (100%), trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 5: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1
không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 6: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2
và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới và giữ lại cột.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới. Thêm 100 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ ống eppendorf.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
+ Phản ứng PCR:
Chuẩn bị các thành phẩn Master mix theo bảng sau:
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
Go taq Green 12,5 Nước tinh khiết 6,5
Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5
DNA mẫu 5
Tổng thể tích 25
Chúng tôi sử dụng cặp mồi cho sản phẩm PCR có kích thước 550bp, có trình tự nucleotide như sau:
Bảng 3.2.Thông tin cặp mồi định tính được sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)
Kích thước sản phẩm
(bp) Tác giả
Mồi xuôi AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA
550
Seon Ah Park et al
2012
Mồi ngược TTCTGACAGCAGGTTGACCA
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của sản phẩm PCR sử dụng
Hoạt động Nhiệt độ Thời Gian Chu kì
Biến tính 950C 2 phút 1 Biến tính 950C 30 giây
40 Gắn mồi 550C 30 giây
Kéo dài 720C 60 giây
Hoàn thành 720C 5 phút 1 Giữ sản phẩm 40C ∞
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1,2%.
• Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Redsafe trong khoảng 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.