Thường sử dụng phương pháp mổ khám toàn diện. Mổ khám chó quan sát các tổn thương đại thể và tiến hành chụp ảnh các tổn thương điển hình.
Bao gồm các bước sau:
Bước 1: Đặt chó nằm trên bàn mổ hoặc tấm ván hay túi nilon đã chuẩn bị trước, dùng dao cắt da và các cơ trong nách tới khớp xương bả vai và kéo dài đến cằm hai bên, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho chó nằm tư thế nằm ngửa.
Bước 2: Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng để bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
Bước 3: Quan sát dịch chứa trong xoang ngực và xoang bụng, kiểm tra những biến đổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kích thước và hình dáng.
Bước 4: Cắt tách lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cùng cắt đứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành. Kéo toàn bộ hệ thống dạ ày ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn các tổ chức khác. Lấy các tổ chức trong cổ, xoang ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
Bước 5: Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim.
Bước 6: Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khí quản,phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và độ đàn hồi.
Bước 7: Rạch kiểm tra chất chứa bên trong thực quản, gạt bỏ chất chứa kiểm tra niệm mạc.
Bước 8: Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra về màu sắc, kích thước, độ cứng mềm, ký sinh trùng, các ổ viêm, hoại tử, ổ áp xe. Rạch bổ gan, lách kiểm tra có bị sưng và tách túi mật kiểm tra niêm mạc.
Bước 9: Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ đôi kiểm tra bên trong thận, kiểm tra bóng đái.
Bước 10: Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba trong cơ thể về màu sắc, kích thước, độ đàn hồi, bổ đôi kiểm tra bên trong có biểu hiện sưng hay không.
Bước 11: Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày đến hậu môn loại bỏ chất chứa và quan sát bề mặt niêm mạc đặc biệt chú ý tới: chất chứa, dịch, màu sắc, điểm hoại tử, xuất huyết.
3.5.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) + Tách chiết DNA + Tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng Kit Qiagen (Dneasy Blood&Tisue Kit-69506.250).
Quy trình tách chiết DNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit, các bước thực hiện như sau:
Xử lý mẫu:
Mẫu bệnh phẩm là mẫu phân, dịch ruột hoặc mẫu nội tạng (ruột, gan, thận, hạch, lách…).
Lấy một lượng mẫu bệnh phẩm tương ứng có khối lượng ≤ 100mg bằng dao và kéo vô trùng vào trong cối sứ. Cắt nhỏ bệnh phẩm bằng kéo và dao. Dùng chày sứ nghiền nhỏ bệnh phẩm cho đến khi thành dạng mịn đồng nhất.
Các bước tách chiết bao gồm:
Bước 1: Chuyển mẫu đã xử lý vào ống eppendorf. Bổ sung 180µl buffer ATL.
Bước 2: Bổ sung 20µl Proteinase K vào ống eppendorf trên, trộn đều ủ ở 560C cho đến khi phân giải hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 200 µl đệm Buffer AL vào ống, trộn đều bằng vortex trong 15 giây, thêm 200µl ethanol (100%), trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 5: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1
không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới giữ lại cột.
Bước 6: Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2
và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới và giữ lại cột.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới. Thêm 100 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ ống eppendorf.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
+ Phản ứng PCR:
Chuẩn bị các thành phẩn Master mix theo bảng sau:
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
Go taq Green 12,5 Nước tinh khiết 6,5
Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5
DNA mẫu 5
Tổng thể tích 25
Chúng tôi sử dụng cặp mồi cho sản phẩm PCR có kích thước 550bp, có trình tự nucleotide như sau:
Bảng 3.2.Thông tin cặp mồi định tính được sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)
Kích thước sản phẩm
(bp) Tác giả
Mồi xuôi AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA
550
Seon Ah Park et al
2012
Mồi ngược TTCTGACAGCAGGTTGACCA
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của sản phẩm PCR sử dụng
Hoạt động Nhiệt độ Thời Gian Chu kì
Biến tính 950C 2 phút 1 Biến tính 950C 30 giây
40 Gắn mồi 550C 30 giây
Kéo dài 720C 60 giây
Hoàn thành 720C 5 phút 1 Giữ sản phẩm 40C ∞
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1,2%.
• Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Redsafe trong khoảng 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.5.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm: Quy trình chuyển đúc mẫu:
Bước 1: Lấy mẫu và cố định
Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy vào trong formol 10% trung tính trong ít nhất 24-48h ở nhiệt độ thường, yêu cầu mẫu bệnh phẩm cần được ngâm ngập trong dung dịch formol và thể tích dung dịch phải gấp dung tích mẫu từ 5-10lần. (chú ý: nếu lọ đựng mẫu nhỏ phải cắt mẫu nhỏ để dung dịch có thể thẩm thấu hết vào trong tổ chức mô bệnh phẩm).
Mẫu sau khi ngâm trong formol 10% từ 24-48h thì có thể cắt chuyển đúc. Cắt mẫu sao cho kích cỡ và hình dáng của mẫu vừa với cassettes.
Bước 3: Chuyển mẫu
Rửa nước: Dưới vòi nước máy, ngâm các cassettes mẫu trong bình nước máy để dưới vòi nước máy chảy trong 30 phút.
Để ngâm trong bình nước cất: chuyển mẫu sang bình nước cất ngâm 30 phút Chuyển ngâm cồn (quy trình bắt đầu từ 10h sáng). Mục đích để đẩy nước ra khỏi mô bào.
Mẫu lấy ra khỏi nước được thấm khô bằng giấy vệ sinh rồi được chuyển lần lượt qua:
Cồn 1: 800/1h, Cồn 2: 900/1h, Cồn 3: 950/2h, Cồn 4 : 950/2h, Cồn 5: 1000/13h;
Cồn 6 : 1000/1h, Cồn 7: 1000/1h, Cồn 8: 1000/1h;
Chuyển ngâm xylen. Mục đích để đẩy cồn ra khỏi mô bào.
Mẫu lấy ra khỏi cồn được thấm khô bằng giấy vệ sinh rồi được chuyển lần lượt qua:
Xylen 1: 1h, Xylen 2: 1h, Xylen 3: 1h;
Chuyển ngâm paraffin. Mục đích để thay thể và đẩy xylen ra khỏi mô bào. Mẫu lấy ra khỏi xylen thấm khô và cho vào lần lượt:
Paraffin 1 : 2h. Sau đó qua paraffin 2: 2h
Bước 4: Đúc mẫu
Chuẩn bị dụng cụ, khuôn mẫu, paraffin. Khi đổ paraffin phải nóng cảy hoàn toàn nhưng nhiệt độ không vượt quá 560C tránh làm khô mẫu.
Cắt và dán mẫu: cắt block bằng máy Microctocom với độ dày 2 - 3µm sao cho mảnh cắt không rách, nát phần mô bào là được, cho vào nước để giãn bệnh phẩm rồi cho vào bể nước ấm 450C. Sau khi bệnh phẩm giãn dùng lam kính vớt bệnh phẩm, để tủ ấm 370C.
Quy trình nhuộm tiêu bản
Tiêu bản sau khi cắt để tủ ấm 370C ít nhất 2h đem đi nhuộm.
Ngâm giỏ tiêu bản lần lượt qua:Xylen 1: 5 phút, Xylen 2: 5 phút, Xylen 3: 5 phút
Bước 2: Khử xylen
Ngâm giỏ tiêu bản lần lượt qua các cốc cồn:
Cồn 1000: 5 phút, Cồn 1000: 5 phút, Cồn 900: 5 phút, Cồn 700: 5 phút
Bước 3: Khử cồn
Rửa nước thường: 5 phút. Ngâm nước cất: 5 phút
Lau khô từng tiêu bản, xếp ngửa lên giá chuẩn bị nhuộm.
Bước 4: Nhuộm Hematoxylin
Thời gian: 12 phút. Rửa nước thường: 3 phút. Ngâm nước cất: 3 phút
Bước 5: Nhuộm Eosin
Thời gian: 5 phút. Rửa nước thường: 2 – 3 phút. Ngâm nước cất: 2 phút
Bước 6: Đẩy nước, nhúng tiêu bản nhiều lần qua các cốc cồn sau nhuộm: Cồn 1: 900/5 phút, Cồn 2: 1000/5 phút, Cồn 3: 1000/5 phút
Bước 7:Khử cồn, nhúng tiêu bản qua các cốc xylen sau nhuộm: Xylen 1: 5 phút, Xylen 2: 5 phút
Bước 8: Gắn lamen
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản (chú y tránh tạo bọt khi gắn lamen), sau đó ghi nhãn lên tiêu bản.
3.5.5. Phương pháp sử lý số liệu
Các số liệu thu thập từ Phòng khám thú y Cộng Đồng được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel 2010.
Xác định các chỉ tiêu theo dõi:
Tổng số con chết
Tỷ lệ chết (%) = x 100 Tổng số con theo dõi
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH MẮC CÁC LOẠI BỆNH Ở CHÓ TẠI PHÒNG KHÁM 4.1.1. Phân loại nhóm bệnh của chó mang đến khám và điều trị 4.1.1. Phân loại nhóm bệnh của chó mang đến khám và điều trị
Trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng khám thú y Cộng đồng – Khoa thú y, từ 10/2017 đến 10/2018có tổng cộng 220 ca bệnh được theo dõi và tiến hành điều trị. Kết quả phân loại các nhóm bệnh được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Phân loại các nhóm bệnh ở chó được mang đến khám và điều trị tại phòng khám thú y Cộng đồng – Khoa thú y STT Nhóm bệnh Số ca mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc bệnh (%) 1 Bệnh truyền nhiễm 86 39,09 2 Bệnh nội khoa 49 22,27 3 Bệnh ký sinh trùng 21 9,54 4 Bệnh ngoại khoa 35 15,90 5 Bệnh sản khoa 29 13,18 Tổng 220 100 Trong đó :
Bệnh truyền nhiễm: thường gặp là các bệnh như viêm ruột tiêu chảy do
Parvovirus, bệnh Care, bệnh xoắn khuẩn do Leptospira...
Bệnh nội khoa: điển hình các bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày ruột, rối loạn tiêu hoá...và các bệnh về đường hô hấp.
Bệnh ký sinh trùng: bao gồm nhóm nội ký sinh trùng (bệnh giun sán) và nhóm ngoại ký sinh trùng như ve, rận, ghẻ, mò bao lông hay nấm.
Bệnh ngoại khoa: như apse, chấn thương, triệt sản, tai nạn...
Bệnh sản khoa: bao gồm đẻ khó, viêm vú, viêm tử cung...
Kết quả bảng 4.1 cho thấy trong tổng số 220 trường hợp mắc bệnh được mang đến khám và điều trị, tỷ lệ chó mắc nhóm bệnh truyền nhiễm cao nhất (39,09%).Truyền nhiễm là nhóm bệnh nguy hiểm, lây lan nhanh. Có
nhiềunguyên nhân dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh của nhóm bệnh truyền nhiễm cao, trong đó có chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh môi trường sống chưa hợp lý; việc tiêm phòng vacxin chưa được chú trọng và người nuôi chưa có ý thức về phòng bệnh cho vật nuôi. Đồng thời, nước ta có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn, virus tồn tại và phát triển, gây bệnh cho vật nuôi. Bên cạnh đó là việc nhập lậu các giống chó từ nước ngoài về không qua kiểm dịch du nhập nhiều mầm bệnh truyền nhiễm mới từ nước ngoài vào.
Nhóm bệnh nội khoa chiếm tỷ lệ khá cao (22,27%). Nhóm bệnh nội khoa thường xuất hiện khi thời tiết bất lợi, con vật không được nuôi dưỡng chăm sóc hợp lý như nằm nơi gió lùa, ít được vận động, thức ăn không phù hợp...
Nhóm bệnh ký sinh trùng có tỷ lệ mắc là 9,54%. Nguyên nhân chính do môi trường sống không sạch sẽ, con vật ăn bẩn, không được tẩy giun sán thường xuyên và định kỳ. Chó là động vật máu nóng, tuyến mồ hôi dưới da không phát triển nên rất dễ bị viêm lỗ chân lông, viêm da. Hơn nữa, chó thường có mùi hôi đặc trưng, mùi này rất rõ khi chó dính phải nước mưa. Vì thế người nuôi chó thường hạn chế mùi này bằng cách tắm bằng dầu tắm, nhưng do thiếu hiểu biết nên cách dùng chưa phù hợp, da thường xuyên bị ẩm ướt, dễ mắc các bệnh ngoại ký sinh trùng.
Nhóm bệnh ngoại khoa và nhóm bệnh sản khoa chiếm tỷ lệ thấp hơn nhóm bệnh truyền nhiễm và nhóm bệnh nội khoa, lần lượt là 15,9% và 13,18%. Các ca bệnh ngoại khoa chủ yếu do tai nạn dẫn đến gãy xương, xây sát dẫn đến nhiễm trùng, apse, ổ mủ... Các bệnh sản khoa hay gặp là đẻ khó đặc biệt các giống chó nhỏ như Chihuahua, Fox hay tụt canxi huyết sau đẻ dẫn đến bại liệt, viêm nhiễm tử cung...
Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirustype 2
Để đánh giá mức độ phổ biến của bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
type 2, tiến hành theo dõi và thống kê tỷ lệ các bệnh thường gặp trong nhóm bệnh truyền nhiễm như Care, viêm gan truyền nhiễm, bệnh do xoắn khuẩn
Leptospira. Tại phòng khám có sử dụng một số test thử nhanh đối với bệnh do
Parvovirus, Care; với các bệnh truyền nhiễm khác thì được gửi mẫu đi để chẩn đoán bệnh. Kết quả thống kê được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỷ lệ mắc các loại bệnh truyền nhiễm tại phòng khám STT Nhóm bệnh Số ca mắc STT Nhóm bệnh Số ca mắc (con) Tỷ lệ mắc bệnh (%) 1 Bệnh Care 28 32,56 2 Bệnh viêm gan truyền nhiễm 7 8,14 3 Bệnh do Leptospira 3 3,49 4 Bệnh do Parvovirus type 2 48 55,81
Tổng 86 100
Hình 4.1. Tỷ lệ chó mắc các bệnh truyền nhiễm
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do
Parvovirustype 2chiếm tỷ lệ cao nhất (56,00%) trong tổng số 86 chó mắc bệnh
truyền nhiễm, tiếp đó là bệnh Care (33,00%), bệnh xoắn khuẩn có tỷ lệ thấp 3,00%, bệnh viêm gan truyền nhiễm chiếm 8,00%. Trong số các ca nhiễm
Parvovirus type 2 không có trường hợp nào bị nhiễm ghép với các bệnh truyền
nhiễm khác. Sau đó, chúng tôi thực hiện chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR và theo dõi triệu chứng lâm sàng trên tất cả các trường hợp cho kết quả dương tính với
Parvovirus type 2.
4.1.2. Kết quả chẩn đoán Parvovirustype 2bằng kỹ thuật PCR với mẫu thu thập
Sau khi có kết quả test dương tính với Parvovirusbằng que thử nhanh tại phòng khám, mẫu bệnh phẩm là phân được thu thập và chuyển về Phòng thí
33% 8% 3% 56% Tỷ lệ mắc các bệnh truyền nhiễm (%) Bệnh Care
Bệnh viêm gan truyền nhiễm
Bệnh do Leptospira Bệnh do Parvovirus type 2
nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y – Khoa Thú y để kiểm tra lại bằng phương pháp PCR. Tổng số có 48mẫu được kiểm tra, kết quả được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Parvovirus type 2 bằng kỹ thuật PCR với mẫu thu thập
STT Giống chó Số lượng mẫu kiểm tra
Kết quả PCR Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 1 Chó Nội 11 9 81,81a 2 Chó Ngoại 31 29 93,50b