Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả thẩm định giống
4.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của giống gốc virus IB chủng RTD IB H120
Quy trình sản xuất vắc-xin trên phôi gà SPF từ virus IB nhược độc chủng H120 được thực hiên qua các bước sau:
1. Kiểm định và bảo quản giống - Giống gốc
- Giống sản xuất 2. Chuẩn bị trứng SPF
3. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất 4.Cấy virus sản xuất vắc-xin
5.Thu hoạch, xử lý và bảo quản vắc-xin bán thành phẩm 6.Sản xuất vắc-xin thành phẩm
Ở mỗi khâu sản xuất đều yêu cầu kỹ thuật chặt chẽ từ nguyên liệu môi trường, thao tác kỹ thuật,...Chỉ cần một khâu bị sai sót là có thể làm ảnh hưởng đến toàn bộ quả trình sản xuất vắc-xin gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Vì vậy, chúng tôi hết sức chú trọng trong quá trình này.
Bên cạnh đó, theo quy định, bất cứ loại vắc-xin nào trước khi xuất xưởng bắt buộc phải kiểm tra đủ 3 chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Đây là những chỉ tiêu chính và cũng là những chỉ tiêu quan trọng không thể thiếu trong quá trình kiểm nghiệm đối với mỗi loại vắc-xin.
4.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH GIỐNG
4.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của giống gốc virus IB chủng RTD IB H120 H120
4.1.1.1. Kiểm tra vô trùng
- Hỗn dịch giống gốc được đông khô và giữ ở -800C do Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam cung cấp.
- Hỗn dịchVirus được pha trở lại bằng PBS.
- Cấy huyễn dịch virus (được cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch thường, nước thịt,nước thị gan
yếm khí vàthạch nấm, mỗi loại 2 ống. Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25-300C).
- Kết quả kiểm tra vô trùng được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra vô trùng giống gốc virus RTD IB H120
MT Ngày Thạchmáu Thạch thường Nước Thịt Yếm Khí Thạch nấm 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - Kết quả Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt
Ghi chú:(-) Âm tính: không có vi khuẩn hoặc nấm mốc (+) Dương tính: có vi khuẩn hoặc nấm mốc
Nhận Xét:Qua bảng 4.1 ta nhận thấy sau 7 ngày theo dõi toàn bộ các môi trường kiểm tra đều không có bất kỳ loại vi khuẩn, nấm nào mọc. Như vậy chủng giống gốc virusRTD IB H120 đạt tiêu chuẩn vô trùng.
4.1.1.2. Xác định hiệu giá giống gốc chủngvirus RTD IB HI20 (EID50)
Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó hiệu lực của vắc-xin được đánh giá là yếu tố quyết định. Một trong những yếu tố quan trọng quyết định hiệu lực của vắc-xin là sự ổn định của giống gốc và tính kháng nguyên cũng như độc lực, sự thích ứng trên môi trường nuôi cấy của giống.
Điều này thể hiện ở hiệu giá của chủng giống gốc. Đối với giống gốc vắc- xin RTD IB H120 chúng tôi xác định hiệu giá bằng phương pháp tính liều gây nhiễm 50% phôi.
Phương Pháp xác định EID50
• Chuẩn bị nguyên vật liệu:
Thiết bị phòng thị nghiệm: buồng cấy, tủ lạnh, tủ ấm, Pipetman, buồng soi mẫu…
• Tiến hành:
Hiệu giá virus RTD IB HI20 được chuẩn độ trên trứng gà SPF có phôi 9 ngày tuổi.
-Trước khi tiêm tiến hành đánh dấu vị trí buồng hơi và đầu phôi.
-Virus được pha loãng theo cơ số 10 với8 nồng độ từ 10-1đến 10-8 bằng PBS, khi tiêm chỉ tiêm 7 nồng độ từ 10-2 đến 10-8, mỗi nồng độ tiêm 5 quả.
-Gây nhiễm virus vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,1ml huyễn dịch virus đã pha loãng. Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi. Những phối chết trước 24h sau khi gây nhiễm được loại bỏ. Những quả chết phôi sau 24h gây nhiễm được bảo quản tủ lạnh dương (2-80C) chờ thu hoạch. Thời gian theo dõi là 5 ngày (120 giờ).
-Mổ trứng thu hoạch nước niệu nang kiểm tra vô trùng và kiểm tra bệnh tích phôi. Bệnh tích phôi ở các nồng độ pha loãng từ 10-2 đến 10-8 phôi xuất huyết, còi cọc, cuộn lại như hình 4.1.
Hình4.1. Phôi gà nhiễm virus RTD IB H120
- Thu dịch niệu nang của những quả trứng này tiến hành làm phản ứng IHA, những phôi nhiễm virus sẽ dương tính với phản ứng IHA.
-Số phôi nhiễm ở các nồng độ gây nhiễm được thống kê và tính liều gây nhiễm 50% (EID50) theo công thức Reed & Muench.
Kết quả thống kê sau khi gây nhiễm virus RTD IB HI20 trên trứng gà có phôi được trình bày ở bảng 4.2
Bảng4.2. Kết quả xác định EID50 của virus RTD IB H120
STT
Độ pha
loãng virus Số phôi TN Số phôi nhiễm Số phôi không nhiễm Số tính toán Tỷ lệ (%) EID50 i n i i + n 1 10-2 5 4 1 20 1 20/21 95,23 105,54 /0,1ml 2 10-3 5 4 1 16 2 16/18 88,88 3 10-4 5 4 1 12 3 12/15 80 4 10-5 5 4 1 8 4 8/12 66,67 5 10-6 5 2 3 4 7 4/11 36,36 6 10-7 5 1 4 2 11 2/13 15,38 7 10-8 5 1 4 1 15 1/16 6,25 Ghi chú:
i: Số phôi nhiễm (cộng dồn từ dưới lên).
n: Số phôi không nhiễm (cộng dồn từ trên xuống). i
i+n
Số phôi nhiễm cộng dồn từ dưới lên Số phôi nhiễm + Số phôi không nhiễm (cộng dồn) (cộng dồn)
Tính toán liều gây nhiễm tối thiểu 50% phôi (EID50) theo công thức của Reed &Muench:
EID50 = ,
, , = 0,54 Giá trị EID50 được tính ra là 5 + 0,23 = 5,54
Vậy hiệu giá của virus RTD IB HI20 là 105,54EID50/0,1ml.
Tiến hành chuẩn độ tương tự ta có kết quả xác định EID50 của giống gốc trung bình thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả xác định EID50 của giống gốc trung bình Số lần Số lần chuẩn độ Độ pha loãng Số trứng trên mỗi nồng độ EID50/0,1ml EID50 trung bình EID50 giống gốc chuẩn 1 10-2 - 10-8 5 105,54 105,35EID50 /0,1ml 105,54EID50 /0,1ml 2 10-2 - 10-8 5 105,45 3 10-2 - 10-8 5 105,06
Nhận xét: qua bảng 4.3 ta thấy giống gốc ổn định do 3 lần chuẩn độ EID50 ít biến động, chỉ số EID50 trung bình là 105,35EID50 /0,1ml xấp xỉ EID50 đã công bố của giống gốc là 105,54EID50/0,1ml.
4.1.1.3. Kiểm tra tính gây miễn dịch
* Chuẩn bị:
- Gà 7 ngày tuổi (không có kháng thể IB trong máu): 30 gà (20 gà miễn dịch và 10 gà đối chứng).
- Virus RTD IB H120 dạng đông khô được pha hoàn toàn nguyên với PBS.
* Tiến hành:
Chuẩn bị 2 lô thí nghiệm
+ Lô miễn dịch: Virus RTD IB H120 được nhỏ vào mắt, mũi, miệng cho 20 gà 7 ngày tuổi. liều 103EID50/con.
+ Lô đối chứng: 10 gà (không nhỏ virus RTD IB H120). Kiểm tra tính gây miễn dịch của virus:
Tại thời điểm 21 ngày sau khi gây miễn dịch lấy máu toàn bộ 20 gà miễn dịch và 10 gà đối chứng, chắt huyết thanh sẽ để xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Kết quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA
Đối tượng Tổng số gàchủng (con) HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) Thí nghiệm 20 0,487 19 95 Đối chứng 10 0.075 0 0
Kết quả kiểm tra tính gây miễn dịch của virus RTD IB H120 cho thấy: + Lô miễn dịch: 19/20 mẫu dương tính có HGKT >0,15 với HGKT trung bình là 0,487. HGKT bảo hộ đạt 95%.
+ Lô đối chứng: 10/10 mẫu âm tính có HGKT < 0,15 với HGKT trung bình là 0,075. HGKT bảo hộ đạt 0%.