Lô gà Số con/lô Liều vắc-xin và đường dung Phương pháp đánh giá
Lô I:
Đối chứng 100 Không dùng vắc-xin
Huyết thanh học (ELISA)
Lô II:
An toàn 50
10 liều vắc-xin ghi trên
nhãn/gà, nhỏ mắt Theo dõi triệu chứng lâm sang
Lô III:
Hiệu lực 350
01 liều vắc-xin ghi trên nhãn/gà, nhỏ mắt
Huyết thanh học (ELISA)
Phương pháp tiến hành
Trước khi chủng vắc-xin, lấy máu toàn đàn gà thí nghiệm. Mỗi con lấy từ 0,5 – 1 ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng để xét nghiệm. Sau khi xét nghiệm chọn lựa gà có kết quả âm tính tiến hành sử dụng vắc-xin trên đàn gà thửnghiệm.
Đàn gà được theo dõi liên tục 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin, mỗi ngày quan sát 2 lần.
Lấy máu gà sau miễn dịch: lấy 50 mẫu máu lô miễn dịch và 20 mẫu lô đối chứng tại các thờiđiểm 14 ngày và 28 ngày sau khi gây miễn dịch.
Phương pháp đánh giá kết quả: Phương pháp ELISA Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Các chỉ tiêu khảo sát, đánh giá:
Chỉ tiêu chọn gà: Gà thí nghiệm không có kháng thể kháng IB trước khi được chủng vắc-xin.
chứng lâm sàng và phảnứng bất lợi do vắc-xin ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và sự phát triển bình thường của gà.
Tỷ lệ chết = ố ế
ố ả á × 100%
Kiểm tra những phảnứng bất lợi và các triệu chứng lâm sàng: Gà được theo dõi về các triệu chứng lâm sàng và các phảnứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin.
Hiệu lực: Dùng phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus IB trong huyết thanh gà sau khi được chủng vắc-xin 14 và 28 ngày.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Thí nghiệm đượcđánh giáđạt khi có tỷ lệ dương tính kháng thểít nhất 80%
3.3.11.Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học
Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vắc-xin và kỹ thuật chủng vắc-xin thực hiện theo quy trình quy định sẵn.
Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà được chủng vắc- xin IB H120 bằng phản ứng ELISA.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢOLUẬN
Để có vắc-xin phòng bệnh cho đàn gà góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh trên gia súc, gia cầm. Hàng năm, Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam đã sản xuất hàng trăm triệu liều vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120. Quy trình sản xuất vắc-xin trên phôi gà SPF từ virus IB nhược độc chủng H120 được thực hiên qua các bước sau:
1. Kiểm định và bảo quản giống - Giống gốc
- Giống sản xuất 2. Chuẩn bị trứng SPF
3. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất 4.Cấy virus sản xuất vắc-xin
5.Thu hoạch, xử lý và bảo quản vắc-xin bán thành phẩm 6.Sản xuất vắc-xin thành phẩm
Ở mỗi khâu sản xuất đều yêu cầu kỹ thuật chặt chẽ từ nguyên liệu môi trường, thao tác kỹ thuật,...Chỉ cần một khâu bị sai sót là có thể làm ảnh hưởng đến toàn bộ quả trình sản xuất vắc-xin gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Vì vậy, chúng tôi hết sức chú trọng trong quá trình này.
Bên cạnh đó, theo quy định, bất cứ loại vắc-xin nào trước khi xuất xưởng bắt buộc phải kiểm tra đủ 3 chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Đây là những chỉ tiêu chính và cũng là những chỉ tiêu quan trọng không thể thiếu trong quá trình kiểm nghiệm đối với mỗi loại vắc-xin.
4.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH GIỐNG
4.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của giống gốc virus IB chủng RTD IB H120 H120
4.1.1.1. Kiểm tra vô trùng
- Hỗn dịch giống gốc được đông khô và giữ ở -800C do Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam cung cấp.
- Hỗn dịchVirus được pha trở lại bằng PBS.
- Cấy huyễn dịch virus (được cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch thường, nước thịt,nước thị gan
yếm khí vàthạch nấm, mỗi loại 2 ống. Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25-300C).
- Kết quả kiểm tra vô trùng được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra vô trùng giống gốc virus RTD IB H120
MT Ngày Thạchmáu Thạch thường Nước Thịt Yếm Khí Thạch nấm 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - Kết quả Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt
Ghi chú:(-) Âm tính: không có vi khuẩn hoặc nấm mốc (+) Dương tính: có vi khuẩn hoặc nấm mốc
Nhận Xét:Qua bảng 4.1 ta nhận thấy sau 7 ngày theo dõi toàn bộ các môi trường kiểm tra đều không có bất kỳ loại vi khuẩn, nấm nào mọc. Như vậy chủng giống gốc virusRTD IB H120 đạt tiêu chuẩn vô trùng.
4.1.1.2. Xác định hiệu giá giống gốc chủngvirus RTD IB HI20 (EID50)
Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó hiệu lực của vắc-xin được đánh giá là yếu tố quyết định. Một trong những yếu tố quan trọng quyết định hiệu lực của vắc-xin là sự ổn định của giống gốc và tính kháng nguyên cũng như độc lực, sự thích ứng trên môi trường nuôi cấy của giống.
Điều này thể hiện ở hiệu giá của chủng giống gốc. Đối với giống gốc vắc- xin RTD IB H120 chúng tôi xác định hiệu giá bằng phương pháp tính liều gây nhiễm 50% phôi.
Phương Pháp xác định EID50
• Chuẩn bị nguyên vật liệu:
Thiết bị phòng thị nghiệm: buồng cấy, tủ lạnh, tủ ấm, Pipetman, buồng soi mẫu…
• Tiến hành:
Hiệu giá virus RTD IB HI20 được chuẩn độ trên trứng gà SPF có phôi 9 ngày tuổi.
-Trước khi tiêm tiến hành đánh dấu vị trí buồng hơi và đầu phôi.
-Virus được pha loãng theo cơ số 10 với8 nồng độ từ 10-1đến 10-8 bằng PBS, khi tiêm chỉ tiêm 7 nồng độ từ 10-2 đến 10-8, mỗi nồng độ tiêm 5 quả.
-Gây nhiễm virus vào xoang niệu nang, mỗi trứng 0,1ml huyễn dịch virus đã pha loãng. Hàn kín lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt độ 370C. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôi. Những phối chết trước 24h sau khi gây nhiễm được loại bỏ. Những quả chết phôi sau 24h gây nhiễm được bảo quản tủ lạnh dương (2-80C) chờ thu hoạch. Thời gian theo dõi là 5 ngày (120 giờ).
-Mổ trứng thu hoạch nước niệu nang kiểm tra vô trùng và kiểm tra bệnh tích phôi. Bệnh tích phôi ở các nồng độ pha loãng từ 10-2 đến 10-8 phôi xuất huyết, còi cọc, cuộn lại như hình 4.1.
Hình4.1. Phôi gà nhiễm virus RTD IB H120
- Thu dịch niệu nang của những quả trứng này tiến hành làm phản ứng IHA, những phôi nhiễm virus sẽ dương tính với phản ứng IHA.
-Số phôi nhiễm ở các nồng độ gây nhiễm được thống kê và tính liều gây nhiễm 50% (EID50) theo công thức Reed & Muench.
Kết quả thống kê sau khi gây nhiễm virus RTD IB HI20 trên trứng gà có phôi được trình bày ở bảng 4.2
Bảng4.2. Kết quả xác định EID50 của virus RTD IB H120
STT
Độ pha
loãng virus Số phôi TN Số phôi nhiễm Số phôi không nhiễm Số tính toán Tỷ lệ (%) EID50 i n i i + n 1 10-2 5 4 1 20 1 20/21 95,23 105,54 /0,1ml 2 10-3 5 4 1 16 2 16/18 88,88 3 10-4 5 4 1 12 3 12/15 80 4 10-5 5 4 1 8 4 8/12 66,67 5 10-6 5 2 3 4 7 4/11 36,36 6 10-7 5 1 4 2 11 2/13 15,38 7 10-8 5 1 4 1 15 1/16 6,25 Ghi chú:
i: Số phôi nhiễm (cộng dồn từ dưới lên).
n: Số phôi không nhiễm (cộng dồn từ trên xuống). i
i+n
Số phôi nhiễm cộng dồn từ dưới lên Số phôi nhiễm + Số phôi không nhiễm (cộng dồn) (cộng dồn)
Tính toán liều gây nhiễm tối thiểu 50% phôi (EID50) theo công thức của Reed &Muench:
EID50 = ,
, , = 0,54 Giá trị EID50 được tính ra là 5 + 0,23 = 5,54
Vậy hiệu giá của virus RTD IB HI20 là 105,54EID50/0,1ml.
Tiến hành chuẩn độ tương tự ta có kết quả xác định EID50 của giống gốc trung bình thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả xác định EID50 của giống gốc trung bình Số lần Số lần chuẩn độ Độ pha loãng Số trứng trên mỗi nồng độ EID50/0,1ml EID50 trung bình EID50 giống gốc chuẩn 1 10-2 - 10-8 5 105,54 105,35EID50 /0,1ml 105,54EID50 /0,1ml 2 10-2 - 10-8 5 105,45 3 10-2 - 10-8 5 105,06
Nhận xét: qua bảng 4.3 ta thấy giống gốc ổn định do 3 lần chuẩn độ EID50 ít biến động, chỉ số EID50 trung bình là 105,35EID50 /0,1ml xấp xỉ EID50 đã công bố của giống gốc là 105,54EID50/0,1ml.
4.1.1.3. Kiểm tra tính gây miễn dịch
* Chuẩn bị:
- Gà 7 ngày tuổi (không có kháng thể IB trong máu): 30 gà (20 gà miễn dịch và 10 gà đối chứng).
- Virus RTD IB H120 dạng đông khô được pha hoàn toàn nguyên với PBS.
* Tiến hành:
Chuẩn bị 2 lô thí nghiệm
+ Lô miễn dịch: Virus RTD IB H120 được nhỏ vào mắt, mũi, miệng cho 20 gà 7 ngày tuổi. liều 103EID50/con.
+ Lô đối chứng: 10 gà (không nhỏ virus RTD IB H120). Kiểm tra tính gây miễn dịch của virus:
Tại thời điểm 21 ngày sau khi gây miễn dịch lấy máu toàn bộ 20 gà miễn dịch và 10 gà đối chứng, chắt huyết thanh sẽ để xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Kết quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA
Đối tượng Tổng số gàchủng (con) HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) Thí nghiệm 20 0,487 19 95 Đối chứng 10 0.075 0 0
Kết quả kiểm tra tính gây miễn dịch của virus RTD IB H120 cho thấy: + Lô miễn dịch: 19/20 mẫu dương tính có HGKT >0,15 với HGKT trung bình là 0,487. HGKT bảo hộ đạt 95%.
+ Lô đối chứng: 10/10 mẫu âm tính có HGKT < 0,15 với HGKT trung bình là 0,075. HGKT bảo hộ đạt 0%.
4.1.2. Kết quả giải mã gen đặc trưng của virus RTD IB H120
4.1.2.1. Tiếp truyền virus
Mẫu virus RTD IB H120 được xử lý và tiêm vào xoang niệu mô của phôi gà SPF 9 ngày tuổi. Sau 72 giờ, chúng tôi tiến hành thu hoạch nước trứng chứa virus RTD IB H120. Tiếp theo đó, tách chiết ARN tông số bằng để làm nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR thi nhận chuỗi gen.
4.1.2.2. Kết quả thu nhận gen S1 và giải trình tự
Xác định chủng virus RTD IB H120 bằng phương pháp RT-PCR, cặp mồi IB-SF1/IB-SR1 đặc hiệu cho đoạn gene S1 đã được sử dụng:
Mồi xuôi IB-SF1: 5’-ATGTTGGTAACACCTCTTTAC-3’ Mồi ngược IB-SRI: 5’-ACGTCTAAAACGACGT GTTCCA-3’
Sản phẩm PCR thu được khí ử dụng cặp mồi IB-SF1/IB-SR1 là 1.611bp. Sản phẩm PCR thu đươc tiến hành giải trình tự gen bằng máy giải trình tự DNA tự động (model 3730; AppliedBiosystem) sử dụng bộ kit Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems).
M 1
Hình 4.2. Kết quả nhân gen S1 của chủng virus RTD IB H120 bằng phản ứng PCR. M: Marker AND (1Kb DNA ladder- INtRON Biotchhnology);
Kết quả giải trình tự gen S1 sẽ được xử lý bằng phần mềm CLUSTAL X ver.1.81 và MegAlign (DNASTAR, Madi-son, WI) và được so sánh với các trình tự gen S1 tham chiếu khác trên ngân hàng giữ liệu gen quốc tế (GenBank). Kết quả phân tích về trình tự gen và amino acid đối với gen S1 cho thấy chủng virus “RTD IB H120” có mức độ tương đồng cao khi so sánh với chủng virus H120 (mã số GenBank là GU393335).
Hình 4.3. Cây phát sinh chủng loại gen S1 giữa chủng RTD IB H120 với các chủng tham chiếu khác
4.2. KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM VẮC-XIN
4.2.1. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc-xin RTD IB H120
Để kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 chế trên phôi gà sạch SPF, mỗi lô vắc-xin chúng tôi lấy mẫu theo QCVN 01-03: 2009/BNNPTNT. Mẫu lô vắc-xin được hoàn nguyên trở lại bằng PBS, sau đó nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nước thịt, thạch máu, thạch thường, nước thịt gan yếm khí và môi trường nuôi cấy nấm: thạch nấm . Hút 0,2 ml vắc-xin cấy vào mỗi ống môi trường, mỗi loại môi trường dùng 2 ống, sau đó để vào tủ ấm 370C/7 ngày, đem kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn, riêng môi trường thạch nấm để ở nhiệt độ phòng 7 ngày (bảng 4.5).
Từ kết quả bảng 4.5 cho thấy, mỗi lô vắc-xin được kiểm tra đều cho kết quả âm tính (không có vi khuẩn hoặc nấm mọc trên các môi trường kiểm tra).
Căn cứ theo TCVN 8684:2011, cả 3 lô trên đều đạt tiêu chuẩn vô trùng. Kết quả này cũng đáp ứng được yêu cầu của OIE, (2016) và tiêu chuẩn ASEAN, (2002).
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra vô trùng văc-xin RTD IB H120
Số lô Thời gian theo dõi
Loại môi trường kiểm tra
Kết luận Thạch máu (2 ống) Thạch thường (2 ống) Nước thịt (2 ống) Yếm khí (2 ống) Thạch nấm (2 ống) Lô 1 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt Lô 2 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt Lô 3 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt 7 ngày -- -- -- -- -- Đạt
Ghi chú: - âm tính (không có vi khuẩn hoặc nấm mọc).
4.2.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin IB H120
Chỉ tiêu an toàn là một trong những chỉ tiêu bắt buộc khi đánh giá chất lượng của bất kỳ vắc-xin nào. Điều quan trọng nhất đối với một loại vắc-xin là phải an toàn và không gây phản ứng nghiêm trọng nào đối với con vật sử dụng vắc-xin. Một vắcxin được đánh giá là an toàn khi tiêm cho bản động vật trong phòng thí nghiệm liều vắc-xin gấp từ 10-100 lần liều sử dụng đốivới vắc-xin nhược độc, động vật không bị chết hoặc không có bất cứ triệu chứng lâm sàng nào có thể quan sát được.
Có rất nhiều phương pháp được sử dụng để đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin RTD IB H120. Nhưng dù bất kỳ phương pháp nào thì cũng phải khẳng định được vắc-xin an toàn hay không an toàn đối với gà sử dụng.
Để kiểm tra an toàn, mỗi lô vắc-xin lấy 5 lọ bất kỳ, pha trở lại bằng PBS vô trùng, trộn đều 5 lọ với nhau, sau đó nhỏ mắt, nhỏ mũi mỗi gà với 10 liều vắc-xin sử dụng. Gà đối chứng không sử dụng vắc-xin được nuôi cách ly với lô thí nghiệm.
Lô an toàn tại nhà nuôi động vật gồm 10 gà được chủng vắc-xin với liều gấp 10 lần chỉ định trên nhãn. Gà được theo dõi liên tục trong thời gian 21 ngày sau khi chủng vắc-xin. Kết quả theo dõi của cả 3 lô cho thấy không có biểu hiện bất thường trên tất cả 10 gà. Như vậy vắc-xin đảm bảo tính an toàn khi sử dụng với liều gấp 10 lần liều chỉ định.
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin nhược độc đông khô H120 Số lô Lứa tuổi Tổng số gà chủng (con) Liều chủng Đường dung Theo dõi sau tiêm Tỷ lệ