* Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I.
Địa chỉ: 30/78 Đường Giải Phóng – Phương Mai - Đống Đa – Hà Nội * Công ty Trách nhiệm hữu hạn một thành viên AVAC Việt Nam. Địa chỉ: Quốc lộ 5A, Ngọc Lịch – Trưng Trắc – Văn Lâm – Hưng Yên Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm, nhà động vật của công ty * Trại chăn nuôi gia công RTD.
Địa chỉ: Khu Đồi Mé – Thanh Vân – Tam Dương – Vĩnh Phúc
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Sản xuất vắc-xin theo quy trình của Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam
Quy trình sản xuất vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 được thực hiện theo sơ đồ Hình 3.1 trong môi trường đảm bảo vô trùng.
Hình3.1. Sơ đồ sản xuất văc-xin RTD IB H120
Giống sản xuất
(Production seed) Trngày tuổi ứng có phôi 9
Trứng SPF có phôi
Gây nhiễm virus vào xoang niệu mô
ấp trứng sau tiêm (370) không đảo trứng, kiểm tra trứng 2 lần/ngày. Chuyển vào tủ lạnh 2 – 80C Kiểm tra: Hiệu gi virus Độ vô trùng Thu hoạch virus Pha chất bổ trợ đông khô (stabilizer và NZ amine)
Bảo quản tủ âm sâu
Đông tan
Pha đông khô
Đông khô Chia Liều Pha giống Kiểm tra: Cảm quan vô trùng, thuần khiết Hiệu lực An toàn Độ ẩm Siết nút nhôm, đóng gói, bảo quản.
3.3.2. Phương pháp tiêm truyền giống virus vào trứng có phôi sản xuất giống gốc gốc
Bước 1: Trứng gà sạch SPF nhập khẩu từ Đức về được kiểm tra loại bỏ những quả rạn nứt, ấp đến 9 ngày tuổi.
Bước 2: Soi trứng loại bỏ những quả vô tinh và chết phôi. Những quả có phôi sống được đánh dấu để tiêm vào xoang niệu mô.
Bước 3: Sát trùng trứng , dùng dùi đục lỗ ở vị trí tiêm.
Bước 4: Pha giống virus và tiêm vào xoang niệu mô 0.1ml/quả trứng. Bước 5: Hàn kín vết tiêm bằng keo hàn và để trong phòng ấm 37ºC theo dõi mỗi ngày 2 lần. Trứng chết trước 24h loại bỏ, từ 48h trở đi cất vào phòng lạnh 2ºC đến 8ºC để co mạch máu.
3.3.3. Phương pháp thu hoạch virus từ phôi trứng đã gây nhiễm
Bước 1: Sát trùng trứng sau đó bộc lộ buồng hơi.
Bước 2: Hút lấy dịch niệu nang, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút sau đó kiểm tra vô trùng bán thành phẩm. Bảo quản ở tủ -40ºC.
Bước 3: Kiểm tra bệnh tích phôi: nếu phôi xuất huyết, còi cọc là phôi đã bị nhiễm virus.
3.3.4. Phương pháp làm IHA
*Nguyên lý:
Virus IB không gây ngưng kết trực tiếp hồng cầu do trên bề mặt capxit không có thụ thể phù hợp với hồng cầu. Để có thể kết dính với hồng cầu gắn lên bề mặt capxit của virus enzym phospholipase chiết tách từ vi khuẩn Clostridium perfringens. Enzym sẽ giúp virus IB gắn vào hồng cầu và gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
*Vật liệu:
- Kháng nguyên thu được từ dịch niệu phôi gà - Đĩa 96 giếng đáy chữ V
- Hồng cầu gà 1% - PBS 1X
* Các bước tiến hành
- Bước 1: Trộn men Phospholipase Clostridium from Perfringens vào kháng nguyên theo tỷ lệ 1:5 ,sau đó ủ ở 37ºC trong 2h rồi mang ra làm phản ứng. - Bước 2:Dùng pipette đa kênh hút 25µl PBS 1X vào 8 giếng theo hàng dọc của đĩa.
- Bước 3: Tra 25µl mẫu kháng nguyên vào giếng đầu tiên, pha loãng theo cơ số 2 đến giếng thứ 7 thì hút bỏ 25µl. giếng cuối cùng làm đối chứng âm không cho mẫu kháng nguyên vào.
- Bước 4: Bổ xung thêm 25µl PBS vào mỗi giếng.
- Bước 5: Nhỏ vào mỗi giếng 25µl hồng cầu gà 1%, chờ 30-45 phút rồi đọc kết quả.
3.3.5. Phương pháp xác định EID50
Dùng 30 trứng tiêm từ nồng độ 10-2đến 10-7 mỗi nồng độ 5 quả, và 3 quả không tiêm dùng để đối chứng.
Sau khi tiêm xong theo dõi như phuơng pháp tiêm truyền giống, sau 96h mổ trứng thu nước làm IHA sau đó tính số phôi nhiễm để đánh giá EID50.
Tính EID50 theo công thức Reed & Muench như bảng 3.1
Bảng 3.1.Công thức Reed & Muench tính EID50
Nồng độ phaloãng Phôi nhiễm Phôi không nhiễm Tổng phôi nhiễmI Tổng phôi không nhiễmN Phần trăm i/(i+n) ×100 10-2 A G A+B+C+D+E+F G M 10-3 B H B+C+D+E+F H+G L 10-4 C I C+D+E+F I+H+G O 10-5 D J D+E+F J+I+H+G P 10-6 E K E+F K+J+I+H+G Q 10-7 F L F L+K+J+I+H+G R
Lấy giá trị cận trên và cận dưới 50% tính theo công thức: EID50 = ậ ê
ậ ê ậ ướ
Giá trị EID50 tính ra theo công thức được cộng với nồng độ pha loãng ở cận trên.
3.3.6. Phương pháp gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm
Gà thí nghiệm là gà khỏe mạnh chưa sử dụng vắc-xin phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, gà được gây miễn dịch bằng vắc-xin IB H120 của công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, đường dùng nhỏ mắt, mũi.
3.3.7. Phương pháp tách huyết thanh
Động vật thí nghiệm sau khi gây miễn dịch được lấy máu để tách huyết thanh. Đối với gà 3 ngày tuổi lấy 0.5ml máu tĩnh mạch cổ, đối với gà 14 ngày trở lên lấy máu tĩnh mạch cánh.
Lấy máu vào xilanh sau đó để nghiêng góc 45º cho đến khi máu đông, để vào tủ ấm 37ºC trong 3-4h, sau đó lấy ra sẽ chắt được huyết thanh ở phía trên có màu vàng, cho vào eppendorf , nếu có dịch đỏ thì hút riêng rồi đem ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hồng cầu , đánh dấu mẫu rồi bảo quản ở tủ -20ºC.
3.3.8. Phương pháp làm phản ứng ELISA để đánh giá lượng kháng thể của gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB
- Pha loãng mẫu kiểm tra theo tỷ lệ pha loãng của nhà sản xuất sau đó mỗi mẫu được nhỏ vào số giếng cần thiết rồi đem ủ trong điều kiện thích hợp. - Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Kháng thể kháng gà cộng hợp với enzym được bổ sung vào các giếng sau đó ủ trong điều kiện thích hợp.
- Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Bổ sung cơ chất có chứa chất tạo màu làm thay đổi màu hiện tại của enzym, đem ủ trong điều kiện thích hợp.
- Cuối cùng bổ sung chất dừng phản ứng.
- Màu của phản ứng được xác định bằng đo mật độ quang học (OD) của mỗi giếng.
- Tỷ lệ mẫu dương tính (Sample to Positive (S/P) ratio) cho mỗi mẫu kiểm tra được tính toán.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá:
S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính
3.3.9. Phương pháp làm RT PCR
Các bước thực hiện E.1. Chiết tách ARN
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất. E.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR E.3. Chu trình nhân gen
E.4. Chạy điện di
Chuẩn bị thạch agaroze 2 % pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 µg/µl). Đổ thạch vào khuôn điện di có lược.
Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch tải).Sử dụng thang chuẩn (Marker) 100 bp trở lên.
Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước).
E.5. Đọc kết quả
Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước mẫu đối chứng dương.Mẫu âm tính: Không có vạch.
E.6. Đánh giá kết quả
Có virus IB trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả RT-PCR dương tính.
3.3.10. Phương pháp thử nghiệm vắc-xin
3.3.10.1. Thử nghiệm vắc-xin tại nhà động vật công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam
a. Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng 50 gà chia làm 3 lô như bảng 3.2để kiểm tra an toàn và hiệu lực
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật
Lô gà Số con/lô Liều vắc-xin và đường dùng Phương pháp đánh giá
Lô I:
Đối chứng 20 Không dùng vắc-xin
Huyết thanh học (ELISA)
Lô II:
An toàn 10
10 liều vắc-xin ghi trên nhãn/gà, nhỏ mắt
Theo dõi triệu chứng lâm sang
Lô III:
Hiệu lực 20
01 liều vắc-xin ghi trên nhãn/gà, nhỏ mắt
Huyết thanh học (ELISA)
b. Phương pháp tiến hành
Trước khi chủng vắc-xin, lấy máu toàn đàn gà thí nghiệm. Mỗi con lấy 0,5 – 1 ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng để xét nghiệm. Sau khi xét nghiệm chọn lựa gà có kết quả âm tính tiến hành sử dụng vắc-xin trên đàn gà thửnghiệm.
Đàn gà được theo dõi liên tục 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin, mỗi ngày quan sát 2 lần.
Lấy máu gà sau miễn dịch: lấy 50 mẫu máu lô miễn dịch và 20 mẫu lô đối chứng tại các thờiđiểm 14 ngày và 28 ngày sau khi gây miễn dịch.
Phương pháp đánh giá kết quả: Phương pháp ELISA Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Các chỉ tiêu khảo sát, đánh giá
Chỉ tiêu chọn gà: Gà thí nghiệm không có kháng thể kháng IB trước khi được chủng vắc-xin.
An toàn: Tính an toàn của vắc-xin là đạt yêu cầu khi gà thử quá liều không có các triệu chứng lâm sàng và phảnứng bất lợi do vắc-xin ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và sự phát triển bình thường của gà.
Tỷ lệ chết = ố ế
ố ả á × 100%
Kiểm tra những phảnứng bất lợi và các triệu chứng lâm sàng: Gà được theo dõi về các triệu chứng lâm sàng và các phảnứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin.
Hiệu lực: Dùng phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus IB trong huyết thanh gà sau khi được chủng vắc-xin 14 và 28 ngày.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
3.3.10.2. Thử nghiệm vắc-xin tại trại chăn nuôi gia công công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam
Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng 500 gà và chia làm 3 lô thí nghiệm như bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm tại trại gia công
Lô gà Số con/lô Liều vắc-xin và đường dung Phương pháp đánh giá
Lô I:
Đối chứng 100 Không dùng vắc-xin
Huyết thanh học (ELISA)
Lô II:
An toàn 50
10 liều vắc-xin ghi trên
nhãn/gà, nhỏ mắt Theo dõi triệu chứng lâm sang
Lô III:
Hiệu lực 350
01 liều vắc-xin ghi trên nhãn/gà, nhỏ mắt
Huyết thanh học (ELISA)
Phương pháp tiến hành
Trước khi chủng vắc-xin, lấy máu toàn đàn gà thí nghiệm. Mỗi con lấy từ 0,5 – 1 ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng để xét nghiệm. Sau khi xét nghiệm chọn lựa gà có kết quả âm tính tiến hành sử dụng vắc-xin trên đàn gà thửnghiệm.
Đàn gà được theo dõi liên tục 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin, mỗi ngày quan sát 2 lần.
Lấy máu gà sau miễn dịch: lấy 50 mẫu máu lô miễn dịch và 20 mẫu lô đối chứng tại các thờiđiểm 14 ngày và 28 ngày sau khi gây miễn dịch.
Phương pháp đánh giá kết quả: Phương pháp ELISA Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Các chỉ tiêu khảo sát, đánh giá:
Chỉ tiêu chọn gà: Gà thí nghiệm không có kháng thể kháng IB trước khi được chủng vắc-xin.
chứng lâm sàng và phảnứng bất lợi do vắc-xin ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và sự phát triển bình thường của gà.
Tỷ lệ chết = ố ế
ố ả á × 100%
Kiểm tra những phảnứng bất lợi và các triệu chứng lâm sàng: Gà được theo dõi về các triệu chứng lâm sàng và các phảnứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vắc-xin.
Hiệu lực: Dùng phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus IB trong huyết thanh gà sau khi được chủng vắc-xin 14 và 28 ngày.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Thí nghiệm đượcđánh giáđạt khi có tỷ lệ dương tính kháng thểít nhất 80%
3.3.11.Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học
Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vắc-xin và kỹ thuật chủng vắc-xin thực hiện theo quy trình quy định sẵn.
Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà được chủng vắc- xin IB H120 bằng phản ứng ELISA.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢOLUẬN
Để có vắc-xin phòng bệnh cho đàn gà góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh trên gia súc, gia cầm. Hàng năm, Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam đã sản xuất hàng trăm triệu liều vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120. Quy trình sản xuất vắc-xin trên phôi gà SPF từ virus IB nhược độc chủng H120 được thực hiên qua các bước sau:
1. Kiểm định và bảo quản giống - Giống gốc
- Giống sản xuất 2. Chuẩn bị trứng SPF
3. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất 4.Cấy virus sản xuất vắc-xin
5.Thu hoạch, xử lý và bảo quản vắc-xin bán thành phẩm 6.Sản xuất vắc-xin thành phẩm
Ở mỗi khâu sản xuất đều yêu cầu kỹ thuật chặt chẽ từ nguyên liệu môi trường, thao tác kỹ thuật,...Chỉ cần một khâu bị sai sót là có thể làm ảnh hưởng đến toàn bộ quả trình sản xuất vắc-xin gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Vì vậy, chúng tôi hết sức chú trọng trong quá trình này.
Bên cạnh đó, theo quy định, bất cứ loại vắc-xin nào trước khi xuất xưởng bắt buộc phải kiểm tra đủ 3 chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Đây là những chỉ tiêu chính và cũng là những chỉ tiêu quan trọng không thể thiếu trong quá trình kiểm nghiệm đối với mỗi loại vắc-xin.
4.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH GIỐNG
4.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của giống gốc virus IB chủng RTD IB H120 H120
4.1.1.1. Kiểm tra vô trùng
- Hỗn dịch giống gốc được đông khô và giữ ở -800C do Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam cung cấp.
- Hỗn dịchVirus được pha trở lại bằng PBS.
- Cấy huyễn dịch virus (được cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch thường, nước thịt,nước thị gan
yếm khí vàthạch nấm, mỗi loại 2 ống. Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25-300C).
- Kết quả kiểm tra vô trùng được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra vô trùng giống gốc virus RTD IB H120
MT Ngày Thạchmáu Thạch thường Nước Thịt Yếm Khí Thạch nấm 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - Kết quả Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt
Ghi chú:(-) Âm tính: không có vi khuẩn hoặc nấm mốc (+) Dương tính: có vi khuẩn hoặc nấm mốc
Nhận Xét:Qua bảng 4.1 ta nhận thấy sau 7 ngày theo dõi toàn bộ các môi trường kiểm tra đều không có bất kỳ loại vi khuẩn, nấm nào mọc. Như vậy chủng giống gốc virusRTD IB H120 đạt tiêu chuẩn vô trùng.
4.1.1.2. Xác định hiệu giá giống gốc chủngvirus RTD IB HI20 (EID50)
Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó hiệu lực của vắc-xin được đánh giá là yếu tố quyết định. Một trong những yếu tố quan trọng quyết định hiệu lực của vắc-xin là sự ổn định của giống gốc và tính kháng nguyên cũng như độc lực, sự thích ứng trên môi trường nuôi cấy của giống.
Điều này thể hiện ở hiệu giá của chủng giống gốc. Đối với giống gốc vắc- xin RTD IB H120 chúng tôi xác định hiệu giá bằng phương pháp tính liều gây