Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó hiệu lực của vắc-xin được đánh giá là yếu tố quyết định. Vì vậy, kiểm tra hiệu lực của vắc-xin là khâu không thể thiếu trong kiểm nghiệm bất kỳ một loại vắc-xin nào.
Để kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120, chúng tôi sử dụng gà 1 tuần tuổi và đường chủng vắc-xin là nhỏ mắt, mũi.
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120 Số lô Đối tượng Tổng số gà chủng (con)
Sau 14 ngày Sau 28 ngày HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) Lô I TN 20 0,295 19 95 0,432 20 100 ĐC 20 0,012 0 0 0,065 0 0 Lô II TN 20 0,334 19 95 0,504 20 100 ĐC 20 0,023 0 0 0,043 0 0 Lô III TN 20 0,302 18 90 0,489 19 95 ĐC 20 0,027 0 0 0,052 0 0 HGKT trung bình 0,310 0,475 Ghi chú: HGKT là hiệu giá kháng thể
ĐC là lô đối chứng, TN là lô thí nghiệm
Vào ngày thứ 14 và 28 sau khi chủng vắc-xin, lấy máu của 20 gà trong lô hiệu lực cùng với 20 gà trong lô đối chứng để kiểm tra phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB) bằng phương pháp ELISA.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
HGKT của gà sau khi chủng vắc-xin 14 ngày đạt trung bình là 0,310. HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 90% đến 95%.
HGKT của gà sau khi chủng vắc-xin 28 ngày đạt trung bình là 0,475. HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 95% đến 100%.
Vắc-xin đạt chỉ tiêu hiệu lực khi gà mẫn cảm được chủng 1 liều vắc-xin, 14 và 28 ngày sau kiểm tra hiệu giá kháng thể gà được bảo hộ.
4.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VẮC-XINRTD IB H120 4.3.1. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin IB H120
Vắc-xin được coi là an toàn khi sử dụng cho cơ thể chưa mắc bệnh phải đạt các yêu cầu sau: Con vật không có phản ứng phụ, không sốt hoặc chỉ sốt nhẹ, ăn uống hoạt động bình thường, không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và sức sảnxuất.
yêu cầu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm vắc-xin tại trại gà của Công ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn làm tương tự như ở nhà động vật với số lượng mỗi lô là 50 con.
Lô an toàn tại traị gàgồm 50 gà được chủng vắc-xin với liều gấp 10 lần chỉ định trên nhãn. Gà được theo dõi liên tục trong thời gian 21 ngày sau khi chủng vắc-xin. Kết quả theo dõi của cả 3 lô cho thấy không có biểu hiện bất thường trên tất cả 50 gà. Như vậy vắc-xin đảm bảo tính an toàn khi sử dụng với liều gấp 10 lần liều chỉ định.
Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin nhược độc đông khô H120 Số lô Lứa tuổi Tổng số gà chủng (con) Liều chủng Đường dùng Theo dõi sau tiêm Tỷ lệ an toàn (%) Lô I Gà 1 tuần tuổi 50 10 liều trên nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100 Lô II Gà 1 tuần tuổi 50 10 liều trên nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100
Lô III Gà 1 tuần
tuổi 50 10 liều trên nhãn Nhỏ mắt, mũi Bình thường 100 Lô ĐC Gà 1 tuần tuổi 50 0 Không nhỏ Bình thường 100
Ghi chú: ĐC là lô gà đối chứng không chủng vắc-xin
Qua bảng 4.8 cho thấy: Tất cả số gà thí nghiệm dùng 10 liều vắc-xin RTD IB H120 vào lúc 1 tuần tuổi theo đường nhỏ mắt, nhỏ mũi cùng với gà đối chứng không sử dụng vắc-xin đều khoẻ mạnh, phát triển bình thường và không có bất kỳ biểu hiện lâm sàng nào của bệnh IB. Tỷ lệ sống ở các lô gà thí nghiệm đều đạt 100% không phát hiện thấy dấu hiệu đường hô hấp đặc trưng nào ở trên các lô gà thí nghiệm.
Điều đó chứng tỏ: Vắc-xin RTD IB H120 đông khô nuôi cấy trên phôi gà rất an toàn khi sử dụng cho gà. Kết quả này đã đáp ứng được những yêu cầu của Asean, 2002 và khuyến cáo của OIE, 2016.
Từ số liệu bảng 4.6và bảng 4.8khẳng định: Cả gà nuôi trong nhà nuôi động vật và gà nuôi ở thực địa, sau khi tiêm vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 qua thời gian theo dõi 21 ngày, tất cả gà đều sống khoẻ mạnh, ăn uống và
hoạt động bình thường, tỷ lệ an toàn đạt 100%. Điều đó chứng tỏ rằng: với quy mô phòng thí nghiệm hay thực địa thì văc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 đều cho kết quả an toàn.
4.3.2.Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120
Tương tự như nhà nuôi động vật, ở thực địa chúng tôi lấy máu của 50 gà trong lô hiệu lực cùng với 20 gà trong lô đối chứng để kiểm tra phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh IB bằng phương pháp ELISA. Hiệu lực của vắc-xin được đánh giá thông qua số gà thí nghiệm được bảo hộ.
Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá: S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ
S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Để kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120, chúng tôi sử dụng gà 1 tuần tuổi và đường chủng vắc-xin là nhỏ mắt, mũi.
Vào ngày thứ 14 và 28 sau khi chủng vắc-xin, lấy máu của 20 gà trong lô hiệu lực cùng với 20 gà trong lô đối chứng để kiểm tra phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB) bằng phương pháp ELISA.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120
Số lô Đối tượng Tổng số gà chủng (con)
Sau 14 ngày Sau 28 ngày HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) HGKT trung bình Số mẫu dương tính HGKT bảo hộ (%) Lô I TN 50 0,298 49 98 0,485 50 100 ĐC 20 0,025 0 0 0.033 0 0 Lô II TN 50 0,302 48 96 0,517 49 98 ĐC 20 0,031 0 0 0,039 0 0 Lô III TN 50 0,312 49 98 0,515 50 100 ĐC 20 0,024 0 0 0,029 0 0 HGKT trung bình các lô TN 0,304 0,506
Ghi chú: HGKT là hiệu giá kháng thể ĐC là lô đôi chứng, TN là lô thí nghiệm
Qua bảng 4.9 trên cho thấy:
HGKT của gà sau khi chủng vắc-xin 14 ngày đạt trung bình là 0,304. HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 90% đến 98%.
HGKT của gà sau khi chủng vắc-xin 28 ngày đạt trung bình là 0,506. HGKT bảo hộ cho gà đạt từ 98% đến 100%.
Trong khi đó lô đối chứng HGKT âm tính và tỷ lệ bảo hộ bằng 0.
Theo 10 TCN 183-93, vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 thích nghi trên phôi gà để sử dụng phòng bệnh cho đàn gà phải đạt được các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực. Vắc-xin được coi là an toàn sau khi dùng cho gà con mẫn cảm liều vắc-xin gấp 10 lần liều sử dụng, đườn dung nhỏ mắt, mũi, theo dõi 21 ngày, gà vẫn ăn uống, hoạt động bình thường. Vắc-xin đạt chỉ tiêu hiệu lực khi gà mẫn cảm được chủng 1 liều vắc-xin, 14 và28 ngày sau kiểm tra hiệu giá kháng thể gà được bảo hộ. Như vậy, qua kết quả nghiên cứu trên khẳng định vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 chế trên phôi gà hoàn toàn vô trùng, có độ an toàn và hiệu lực cao.
4.3.3.Kết quả đánh giá độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm vắc-xin bằng phương pháp kiểm tra HGKT
Độ dài miễn dịch của gà chính là khả năng duy trì sự tồn tại trạng thái miễn dịch trong cơ thể gà thí nghiệm được gây ra do chủng vắc-xin RTD IB H120 nhược độc. Khả năng miễn dịch của gà được chủng vắc-xin càng dài bao nhiêu thì càng chứng tỏ được sự bảo hộ của vắc-xin đối với gà bấy nhiêu.
Độ dài miễn dịch của gà sau khi chủng vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 được thể hiện qua tỷ lệ bảo hộ gà của vắc-xin sau các thời gian chủng.
Kháng thể không xuất hiện ngay sau khi tiêm mũi tiêm đầu trước 24 giờ mà chỉ xuất hiện sau 24 giờ trở đi, lượng kháng thể sẽ tăng dần đến mức bảo hộ.
Theo Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2009) khi đưa vắc-xin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vắc-xin và sự xâm nhập của kháng nguyên lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba...sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2-3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm.
Lô thí nghiệm: 100 gà được sử dụng vắc-xin RTD IB H120 theo đường Nhỏ mắt, mũi, mỗi con 1 liều vắc-xin.
Lô đối chứng: 50 gà không sử dụng vắc-xin. Các lô gà nuôi cách ly, được chăm sóc nuôi dưỡng trong điều kiện có kiểm soát về dinh dưỡng, nước uống và các điều kiện vệ sinh thú y.
Gà các lô được tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh vào các thời điểm 7, 14, 21, 28, 35, 42 và 49 ngày tuổi.
Mỗi lần lấy máu đều lấy ngẫu nhiên, lô thí nghiệm I lấy 10 mẫu, lô thí nghiệm II lấy 5 mẫu. Máu gà sau khi lấy, được cho vào ống lấy máu chuyên dụng, để nghiêng và cố định trong 15 phút cho máu đông hoàn toàn. Sau đó ủ ấm 370C/ 1 giờ. Chắt huyết thanh, vô hoạt ở 560C trong 30 phút để diệt bổ thể và bảo quản ở nhiệt độ -200C chờ kiểm tra kháng thể.
Các mẫu huyết thanh gà được xác định hiệu giá kháng thể IB bằng phương pháp ELISA. Kết quả được trình bày ở bảng 4.10
Bảng 4.10. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung bình IB trong huyết thanh của gà được sử dụng vắc-xin RTD IB H120 bằng phản ứng ELISA
Thời điểm kiểm tra Lô thí nghiệm Lô đối chứng
7 ngày 0,125 0,110 14 ngày 0,162 0,097 21 ngày 0,298 0,08 28 ngày 0,375 0,06 35 ngày 0,501 0 42 ngày 0,366 0 49 ngày 0,153 0
Kháng thể IB được xác định bằng phương pháp ELISA có sử dụng bộ Kit của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá:
S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính
Từ kết quả trên cùng với tiêu chuẩn của bộ kit, chúng tôi nhận thấy: Tại thời điểm 7 ngày tuổi hiệu giá kháng thể trung bình của gà các lô đều nhỏ hơn 0,15 (lô thí nghiệm là 0,125 và lô đối chứng là 0,110).
thể IB bắt đầu tăng nhẹ (0,162 ), 14 ngày sau khi chủng vắc-xin RTD IB H120, hiệu giá kháng thể tăng cao lên đến 0,298, rồi 21 ngày sau chủng văc-xin HGKT đạt 0,375 và đạt đỉnh cao ở 35 ngày tuổi là 0,501. Sau đó hiệu giá kháng thể giảm dần đến 49 ngày tuổi chỉ còn 0,153.
Trong khi đó, lô đối chứng - gà không được sử dụng vắc-xin, hiệu giá kháng thể thụ động giảm dần và không phát hiện được kháng thể ở 35 ngày tuổi.
Như vậy, gà được sử dụng vắc-xin RTD IB H120 vào lúc 7 ngày tuổi được bảo hộ với bệnh IB đến 49 ngày tuổi.
Làm tương tự như trên với các lô tiếp theo ta có độ dài miễn dịch của gà được thể hiện ở biểu đồ hình 4.4
Hình4.4. Biểu đồ thể hiện độ dài miễn dịch của vắc-xin
Như vậy, nhìn vào biểu đồ hình 4.4 có thể quan sát rõ hơn sự ổn định hay giảm xuống về hiệu giá kháng thể của gà ở mỗi lô vắc-xin qua từng thời điểm kiểm tra độ dài miễn dịch.
Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi khẳng định: gà sau khi chủng vắc-xin từ 7 ngày đến 42 ngày vẫn bảo hộ được đối với sự tấn công của virus cường độc. Điều này chứng tỏ gà được chủng vắc-xin nhược độc đông khôRTD IB H120 chế trên phôi gà sạch SPF có độ dài miễn dịch đến 49 ngày tuổi khi chủng vắc-xin ở thời điểm gà 7 ngày tuổi.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 42 ngày 49 ngày
Lô I Lô II Lô III 0,15
4.3.4. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của vắc-xin RTD IB H120 đông khô
Bệnh IB là bệnh thường tiến triển ở thể cấp tính, tỷ lệ tử vong cao, bệnh xảy ra hầu như quanh năm. Vì thế, việc sản xuất dự trữ đủ một lượng vắc-xin nhằm đáp ứng nhu cầu của thực tiễn chăn nuôi là rất cần thiết. Trong quá trình lưu kho dự trữ, điều kiện bảo quản tốt để không làm giảm chất lượng vắc-xin là không thể thiếu. Vấn đề đặt ra ở đây là vắc-xin sau khi sản xuất, bảo quản ở 2o-8oC thời gian bảo quản kéo dài được bao lâu mà hiệu lực của nó không bị ảnh hưởng. Do đó, việc đưa ra thông tin về thời hạn bảo quản của vacxin đối với nhà sản xuất và người tiêu dùng là rất cần thiết.
Trong quá trình bảo quản vào các thời điểm 0 tháng, 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng 12 tháng, 15 tháng và 18 tháng chúng tôi tiến hành lấy mẫu các lô vắc-xin thí nghiệm kiểm tra vật lý và chuẩn độ xác định hiệu giá virus trong các mẫu vắc-xin.
Kiểm tra vật lý gồm có kiểm tra độ ẩm và kiểm tra độ chân không. − Kiểm tra độ ẩm:
Ta có nhiều phương pháp để xác định độ ẩm như: Phương pháp sấy khô vắc-xin trong chân không, phương pháp xác định độ ẩm không hoàn toàn hoặc phương pháp cộng hưởng từ tính nguyên tử. Việc xác định độ ẩm vắc-xin RTD IB H120 được tiến hành kiểm tra trên thiết bị phân tích độ ẩm - Sartorius MA. Thiết bị đo độ ẩm theo phương pháp làm mất nước trong mẫu bằng nhiệt sử dụng tia hồng ngoại, halogen và vi sóng. Thiết bị cho kết quả phân tích sau 3 - 15 phút.
− Kiểm tra độ chân không:
Mức độ chân không trong từng lọ vắc-xin đông khô thường được xác định bằng một thiết bị kiểm tra phát ra các tia sáng có tần số cao (high frequency). Thiết bị này phát hiện sự có mặt và mức độ chân không của từng lọ vắc-xin. Khi kiểm tra, người ta đưa thiết bị qua từng lọ vắc-xin được đặt nằm ngang, nếu thiết bị phát ánh sáng màu tím đậm thì lọ vắc-xin có chân không cao, nếu thiết bị phát ra ánh sáng màu tím nhạt hoặc xanh thì lọ vắc-xin đó có chân không thấp hoặc không có chân không. Những lọ vắc-xin không có chân không sẽ bị loại bỏ.
Ba lô thí nghiệm, mỗi thời điểm lấy 5 lọ vắc-xin bất kỳ của 1 lô thí nghiệm. Các lọ này được kiểm tra các chỉ tiêu vật lý của vắc-xin đông khô như hình thái, màu sắc,… sau đó được hoàn nguyên trở lại bằng dung dịch PBS, trộn lại với nhau, và tiến hành chuẩn độ để xác định hiệu giá virus trong 1 liều vắc-xin.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.12
Qua kết quả ở bảng 4.12 cho thấy: Cả 3 lô thí nghiệm đều cho kết quả kiểm tra vật lý đạt ở các thời điểm bảo quản khác nhau và đều có hiệu giá virus đạt ở mức cho phép (>103,0 EID50), không có mẫu nào có hiệu giá virus không đạt (< 103,0 EID50 ).
Ở thời điểm bảo quản 18 tháng, cả 3 lô thí nghiệm đều có hiệu giá virus ổn định và đạt tiêu chuẩn.
Vậy qua các lô thí nghiệm trên đã cho thấy: Virus IB có tính kháng nguyên bền vững và ổn định với nhiệt độ trong quá trình đông khô và trong thời gian bảo quản, hiệu giá virus là ổn định, không thay đổi trong các lô đã kiểm tra và đạt 103,6 EID50, hiệu giá này bằng hiệu giá virus của một liều vắc-xin RTD IB H120 khi mới sản xuất.
Bảng 4.11. Kết quả xác định độ ổn định của vắc-xin RTD IB H120 đông khô