Nồng độ phaloãng Phôi nhiễm Phôi không nhiễm Tổng phôi nhiễmI Tổng phôi không nhiễmN Phần trăm i/(i+n) ×100 10-2 A G A+B+C+D+E+F G M 10-3 B H B+C+D+E+F H+G L 10-4 C I C+D+E+F I+H+G O 10-5 D J D+E+F J+I+H+G P 10-6 E K E+F K+J+I+H+G Q 10-7 F L F L+K+J+I+H+G R
Lấy giá trị cận trên và cận dưới 50% tính theo công thức: EID50 = ậ ê
ậ ê ậ ướ
Giá trị EID50 tính ra theo công thức được cộng với nồng độ pha loãng ở cận trên.
3.3.6. Phương pháp gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm
Gà thí nghiệm là gà khỏe mạnh chưa sử dụng vắc-xin phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, gà được gây miễn dịch bằng vắc-xin IB H120 của công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, đường dùng nhỏ mắt, mũi.
3.3.7. Phương pháp tách huyết thanh
Động vật thí nghiệm sau khi gây miễn dịch được lấy máu để tách huyết thanh. Đối với gà 3 ngày tuổi lấy 0.5ml máu tĩnh mạch cổ, đối với gà 14 ngày trở lên lấy máu tĩnh mạch cánh.
Lấy máu vào xilanh sau đó để nghiêng góc 45º cho đến khi máu đông, để vào tủ ấm 37ºC trong 3-4h, sau đó lấy ra sẽ chắt được huyết thanh ở phía trên có màu vàng, cho vào eppendorf , nếu có dịch đỏ thì hút riêng rồi đem ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hồng cầu , đánh dấu mẫu rồi bảo quản ở tủ -20ºC.
3.3.8. Phương pháp làm phản ứng ELISA để đánh giá lượng kháng thể của gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB
- Pha loãng mẫu kiểm tra theo tỷ lệ pha loãng của nhà sản xuất sau đó mỗi mẫu được nhỏ vào số giếng cần thiết rồi đem ủ trong điều kiện thích hợp. - Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Kháng thể kháng gà cộng hợp với enzym được bổ sung vào các giếng sau đó ủ trong điều kiện thích hợp.
- Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Bổ sung cơ chất có chứa chất tạo màu làm thay đổi màu hiện tại của enzym, đem ủ trong điều kiện thích hợp.
- Cuối cùng bổ sung chất dừng phản ứng.
- Màu của phản ứng được xác định bằng đo mật độ quang học (OD) của mỗi giếng.
- Tỷ lệ mẫu dương tính (Sample to Positive (S/P) ratio) cho mỗi mẫu kiểm tra được tính toán.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Kit ELISA của hãng Synbiotics có tiêu chuẩn đánh giá:
S/P > 0,15 => Đạt ngưỡng bảo hộ S/P ≤ 0,15 => Âm tính
3.3.9. Phương pháp làm RT PCR
Các bước thực hiện E.1. Chiết tách ARN
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất. E.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR E.3. Chu trình nhân gen
E.4. Chạy điện di
Chuẩn bị thạch agaroze 2 % pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 µg/µl). Đổ thạch vào khuôn điện di có lược.
Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch tải).Sử dụng thang chuẩn (Marker) 100 bp trở lên.
Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước).
E.5. Đọc kết quả
Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước mẫu đối chứng dương.Mẫu âm tính: Không có vạch.
E.6. Đánh giá kết quả
Có virus IB trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả RT-PCR dương tính.
3.3.10. Phương pháp thử nghiệm vắc-xin
3.3.10.1. Thử nghiệm vắc-xin tại nhà động vật công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam
a. Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng 50 gà chia làm 3 lô như bảng 3.2để kiểm tra an toàn và hiệu lực