Khi đưa vắc-xin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức, mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa
trong vắc-xin và sự xâm nhập của kháng nguyên trong vắc-xin lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba... Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất rồi giảm dần và mất đi theo thời gian nhất định.
Sử dụng vắc-xin lần đầu đáp ứng miễn dịch được gọi là sơ cấp hay tiên phát. Sử dụng vắc-xin lần hai đáp ứng miễn dịch được gọi là thứ cấp hay thứ phát. Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn.
Sự khác biệt của đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch. Trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh và mạnh, tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn nên kháng thể xuất hiện sớm, hàm lượng nhiều hơn rõ rệt. Nếu cách lần dùng vắc-xin đầu tiên 3-4 tuần , sử dụng tiếp lần thứ hai thì đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn. Đây là cơ sở khoa học cho việc tiêm phòng vắc-xin nhắc lại tạo mức độ miễn dịch cao cho cơ thể.
Khi kiểm tra hàm lượng kháng thể trong cơ thể đã sử dụng vắc-xin kết hợp với phương pháp công cường độc, người ta nhận thấy rằng: không phải kháng thể cứ xuất hiện trong máu là con vật được bảo vệ khỏi sự tấn công của mầm bệnh cường độc mà lượng kháng thể phải đạt đến một trị số nhất định thì cơ thể mới có mức độ miễn dịch bảo vệ. Trị số kháng thể này được gọi là ngưỡng bảo hộ. Hàm lượng kháng thể càng cao hơn ngưỡng bảo hộ thì mức độ miễn dịch của cơ thể càng cao và ngược lại.
Mỗi loại vắc-xin khi đưa vào cơ thể sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch và trạng thái miễn dịch ở động vật được duy trì một thời gian nhất định gọi là độ dài miễn dịch. Tùy từng loại vắc-xin mà thời gian này dài hay ngắn khác nhau, khi hết thời gian đó, cơ thể không con khả năng chống lại mầm bệnh nữa, vì vậy người ta phải tiến hành tái chủng.
Như vậy để duy trì đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch, cứ khoảng một thời gian nhất định nên tái chủng vắc-xin một lần cho động vật tùy theo loại vắc-xin, tùy theo động vật và tình hình dịch tễ. (Nguyễn Bá Hiên, 2010).
Theo Nguyễn Hồng Minh (2012)Kháng thể thụ động kháng virus Viêm phế quản truyền nhiễm chỉ có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại chủng virus cường độc ở 1 ngày đến 1 tuần tuổi, nhưng đến 2 tuần tuổi thì không còn tác
dụng. Nếu phòng bệnh cho đàn gà con ở thời điểm sớm sẽ làm giảm mạnh kháng thể truyền từ mẹ và giảm hiệu quả sử dụng của vắc-xin nếu chủng virus vắc-xin cùng type với loại virus vắc-xin sử dụng trong quá trình tạo miễn dịch ở đàn gà giống, gà đẻ.
Sức đề kháng của gà đối với virus Viêm phế quản truyền nhiễm phụ thuộc vào các chủng và các giống gà.
Otsuki et al. (1990), Nakamura et al.(1991) đã so sánh những dấu hiệu lâm sàng, sự phát triển của virus Viêm phế quản truyền nhiễm trong các mô và sự phá hủy tổ chức biểu mô khí quản của hai giống gà lơgo trắng lai cận dòng (dòng 151 - dòng mẫn cảm cao với virus và dòng C - dòng có sức đề kháng cao với virus) đã phát hiện ra rằng, ở dòng C, virus chỉ tồn tại ở khí quản từ 7 đến 12 ngày sau khi gây nhiễm, trong khi đó nếu cùng gây nhiễm chủng virus đó đối với dòng 151 thì virus tồn tại từ 16 – 21 ngày sau khi gây nhiễm.
Tỷ lệ chết khác nhau giữa các giống gà khác nhau khi gây nhiễm hoặc chỉ một mình virus Viêm phế quản truyền nhiễm hoặc kết hợp giữa virus Viêm phế quản truyền nhiễm và Escherichia coli. Sự khác nhau về mức độ mẫn cảm của các dòng gà với virus Viêm phế quản truyền nhiễm còn phụ thuộc vào các phương pháp phát hiện và các phương pháp làm phản ứng.
Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế và thời gian đáp ứng miễn dịch của gà sau khi nhiễm virus Viêm phế quản truyền nhiễm, qua đó xác định được virus Viêm phế quản truyền nhiễm là đa serotyp và giữa các serotyp không tạo sự bảo hộ chéo cho nhau. Các tác giả đã chỉ ra rằng gà chỉ hồi phục từ sự nhiễm bệnh tự nhiên khi nó đề kháng lại độc lực của chính virus đó (sự bảo vệ tương đồng), còn đối với các chủng virus Viêm phế quản truyền nhiễm khác thì phạm vi bảo hộ của gà là rất khác nhau (sự bảo vệ khác loài). Do vậy trong quá trình nghiên cứu virus Viêm phế quản truyền nhiễm, điều quan trọng nhất là phải xác định sự biến đổi độc lực giữa các chủng virus lây nhiễm là rất cần thiết. Trên cơ sở đó đánh giá sức đề kháng của các dòng gà khác nhau đối với các chủng virus Viêm phế quản truyền nhiễm khác nhau.
Mức độ bảo vệ đường hô hấp khi gây nhiễm virus Viêm phế quản truyền nhiễm hoặc khi tiêm phòng thường được đánh giá sau 3 – 4 ngày gây nhiễm và dựa trên nhiều tiêu chuẩn khác nhau. Tiêu chuẩn quan trọng nhất là sử dụng chủng cường độc gây bệnh thẳng vào đường hô hấp, sau 4 – 5 ngày công cường độc nếu không phát hiện được virus Viêm phế quản truyền nhiễm từ khí quản của
gà thì được coi là một tiêu chuẩn của đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, để đánh giá hoàn chỉnh phải dựa vào hai hoặc nhiều hơn các tiêu chuẩn chống lại sự tác động của chủng cường độc như: Không phân lập được virus trong thận và đường sinh dục, không có dấu hiệu lâm sàng của bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm, không có bệnh tích ở khí quản hoặc sự phá hủy nhu động lông rung khí quản. Điểm tích luỹ lại của các tiêu chuẩn được sử dụng để chỉ ra mức độ bảo vệ là toàn bộ, một phần hay không có gì. Một phương pháp thay thế dùng để ước tính gà đã được chủng vắc-xin có được bảo hộ và không bị chết khi công cường độc hay không là dùng phối hợp virus Viêm phế quản truyền nhiễm và E.coli. Phương pháp này đã chứng minh sự bảo hộ chéo của vắc-xin và sử dụng hiệu quả hơn phương pháp đánh giá miễn dịch khí quản.
Sự bảo hộ đàn gà ở những khu vực có những chủng gây bệnh thể thận là một tiêu chuẩn rất quan trọng đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắc-xin.
Khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn sự giảm sản lượng trứng sau khi gây nhiễm các chủng cường độc là bằng chứng chứng minh sự bảo hộ của vắc-xin đối với các đàn gà đẻ.
Ignjatovic và Galli (1994) cho rằng glycopolypeptide S1 chịu trách nhiệm chính trong việc sinh ra kháng thể trung hoà virus, kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu và là quy luật chính tạo ra miễn dịch bảo vệ cơ thể.
Các kháng thể trung hoà cục bộ có thể được tổng hợp ở khu vực đường hô hấp trên và ngăn chặn được sự lây nhiễm trở lại. Ngoài ra, có những chứng minh về sự đóng góp của tuyến harder trong đáp ứng miễn dịch cục bộ.
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với virus Viêm phế quản truyền nhiễm bao gồm: Phản ứng biến đổi tế bào lympho của những đàn gà đã sử dụng vắc-xin nhược độc và vắc-xin vô họat, hoạt tính của các lympho gây độc tế bào, hoạt tính của tế bào giết tự nhiên và các phản ứng mô học về cách nhận biết các tế bào T thẩm xuất trong mô của đường hô hấp và thận của những gà bị nhiễm virus Viêm phế quản truyền nhiễm (đặc biệt là phenotype TCD4+). Tuy nhiên, vai trò đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của virus Viêm phế quản truyền nhiễm cũng chưa được biết đến.
Interferon được sinh ra do sự kích thích của virus Viêm phế quản truyền nhiễm biến đổi theo các chủng virus, nhưng vai trò của interferon trong việc chống lại sự xâm nhập của virus Viêm phế quản truyền nhiễm cũng chưa được giải thích rõ.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊN CỨU 3.1.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1. Thẩm định giống
Giống virus IB chủng H120 được thẩm định các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực, hiệu giá và giải trình tự gen.
3.1.2. Kiểm nghiệm vắc-xin
Vắc-xin nhược độc đông khô phòng bệnh IB chủng H120 được sản xuất theo quy trình của Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam sau đó tiến hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực.
3.1.3. Thử nghiệm vắc-xin RTD IB H120
- Thử nghiệm các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực và xác định hiệu giá của vắc-xin RTD IB H120.
Tại nhà động vật của Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam. Trại chăn nuôi gia công – Công ty RTD.
- Xác định độ dài miễn dịch và thời gian bảo quản vắc-xin RTD IB H120.
3.2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vắc-xin nhược độc đông khô phòng bệnh IB chủng H120 sản xuất tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam.
Thành phần: Mỗi liều vắc-xin chứa tối thiểu 103EID50 virus viêm phế quản truyền nhiễm, chủng H120.
3.2.2. Nguyên liệu
- Giống virus IB chủng H120.
- Trứng gà sạch SPF nhập khẩu từ Đức có phôi ấp đến 9- 10 ngày tuổi. - Gà con từ 3 ngày tuổi nuôi tại nhà động vật Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam và Trại gà Thanh Vân - Tam Dương – Vĩnh Phúc. Là gà khỏe mạnh và chưa sử dụng vắc-xin phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB).
3.2.3. Địa điểm nghiên cứu
* Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I.
Địa chỉ: 30/78 Đường Giải Phóng – Phương Mai - Đống Đa – Hà Nội * Công ty Trách nhiệm hữu hạn một thành viên AVAC Việt Nam. Địa chỉ: Quốc lộ 5A, Ngọc Lịch – Trưng Trắc – Văn Lâm – Hưng Yên Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm, nhà động vật của công ty * Trại chăn nuôi gia công RTD.
Địa chỉ: Khu Đồi Mé – Thanh Vân – Tam Dương – Vĩnh Phúc
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Sản xuất vắc-xin theo quy trình của Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam
Quy trình sản xuất vắc-xin nhược độc đông khô RTD IB H120 được thực hiện theo sơ đồ Hình 3.1 trong môi trường đảm bảo vô trùng.
Hình3.1. Sơ đồ sản xuất văc-xin RTD IB H120
Giống sản xuất
(Production seed) Trngày tuổi ứng có phôi 9
Trứng SPF có phôi
Gây nhiễm virus vào xoang niệu mô
ấp trứng sau tiêm (370) không đảo trứng, kiểm tra trứng 2 lần/ngày. Chuyển vào tủ lạnh 2 – 80C Kiểm tra: Hiệu gi virus Độ vô trùng Thu hoạch virus Pha chất bổ trợ đông khô (stabilizer và NZ amine)
Bảo quản tủ âm sâu
Đông tan
Pha đông khô
Đông khô Chia Liều Pha giống Kiểm tra: Cảm quan vô trùng, thuần khiết Hiệu lực An toàn Độ ẩm Siết nút nhôm, đóng gói, bảo quản.
3.3.2. Phương pháp tiêm truyền giống virus vào trứng có phôi sản xuất giống gốc gốc
Bước 1: Trứng gà sạch SPF nhập khẩu từ Đức về được kiểm tra loại bỏ những quả rạn nứt, ấp đến 9 ngày tuổi.
Bước 2: Soi trứng loại bỏ những quả vô tinh và chết phôi. Những quả có phôi sống được đánh dấu để tiêm vào xoang niệu mô.
Bước 3: Sát trùng trứng , dùng dùi đục lỗ ở vị trí tiêm.
Bước 4: Pha giống virus và tiêm vào xoang niệu mô 0.1ml/quả trứng. Bước 5: Hàn kín vết tiêm bằng keo hàn và để trong phòng ấm 37ºC theo dõi mỗi ngày 2 lần. Trứng chết trước 24h loại bỏ, từ 48h trở đi cất vào phòng lạnh 2ºC đến 8ºC để co mạch máu.
3.3.3. Phương pháp thu hoạch virus từ phôi trứng đã gây nhiễm
Bước 1: Sát trùng trứng sau đó bộc lộ buồng hơi.
Bước 2: Hút lấy dịch niệu nang, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút sau đó kiểm tra vô trùng bán thành phẩm. Bảo quản ở tủ -40ºC.
Bước 3: Kiểm tra bệnh tích phôi: nếu phôi xuất huyết, còi cọc là phôi đã bị nhiễm virus.
3.3.4. Phương pháp làm IHA
*Nguyên lý:
Virus IB không gây ngưng kết trực tiếp hồng cầu do trên bề mặt capxit không có thụ thể phù hợp với hồng cầu. Để có thể kết dính với hồng cầu gắn lên bề mặt capxit của virus enzym phospholipase chiết tách từ vi khuẩn Clostridium perfringens. Enzym sẽ giúp virus IB gắn vào hồng cầu và gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
*Vật liệu:
- Kháng nguyên thu được từ dịch niệu phôi gà - Đĩa 96 giếng đáy chữ V
- Hồng cầu gà 1% - PBS 1X
* Các bước tiến hành
- Bước 1: Trộn men Phospholipase Clostridium from Perfringens vào kháng nguyên theo tỷ lệ 1:5 ,sau đó ủ ở 37ºC trong 2h rồi mang ra làm phản ứng. - Bước 2:Dùng pipette đa kênh hút 25µl PBS 1X vào 8 giếng theo hàng dọc của đĩa.
- Bước 3: Tra 25µl mẫu kháng nguyên vào giếng đầu tiên, pha loãng theo cơ số 2 đến giếng thứ 7 thì hút bỏ 25µl. giếng cuối cùng làm đối chứng âm không cho mẫu kháng nguyên vào.
- Bước 4: Bổ xung thêm 25µl PBS vào mỗi giếng.
- Bước 5: Nhỏ vào mỗi giếng 25µl hồng cầu gà 1%, chờ 30-45 phút rồi đọc kết quả.
3.3.5. Phương pháp xác định EID50
Dùng 30 trứng tiêm từ nồng độ 10-2đến 10-7 mỗi nồng độ 5 quả, và 3 quả không tiêm dùng để đối chứng.
Sau khi tiêm xong theo dõi như phuơng pháp tiêm truyền giống, sau 96h mổ trứng thu nước làm IHA sau đó tính số phôi nhiễm để đánh giá EID50.
Tính EID50 theo công thức Reed & Muench như bảng 3.1
Bảng 3.1.Công thức Reed & Muench tính EID50
Nồng độ phaloãng Phôi nhiễm Phôi không nhiễm Tổng phôi nhiễmI Tổng phôi không nhiễmN Phần trăm i/(i+n) ×100 10-2 A G A+B+C+D+E+F G M 10-3 B H B+C+D+E+F H+G L 10-4 C I C+D+E+F I+H+G O 10-5 D J D+E+F J+I+H+G P 10-6 E K E+F K+J+I+H+G Q 10-7 F L F L+K+J+I+H+G R
Lấy giá trị cận trên và cận dưới 50% tính theo công thức: EID50 = ậ ê
ậ ê ậ ướ
Giá trị EID50 tính ra theo công thức được cộng với nồng độ pha loãng ở cận trên.
3.3.6. Phương pháp gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm
Gà thí nghiệm là gà khỏe mạnh chưa sử dụng vắc-xin phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, gà được gây miễn dịch bằng vắc-xin IB H120 của công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, đường dùng nhỏ mắt, mũi.
3.3.7. Phương pháp tách huyết thanh
Động vật thí nghiệm sau khi gây miễn dịch được lấy máu để tách huyết thanh. Đối với gà 3 ngày tuổi lấy 0.5ml máu tĩnh mạch cổ, đối với gà 14 ngày trở lên lấy máu tĩnh mạch cánh.
Lấy máu vào xilanh sau đó để nghiêng góc 45º cho đến khi máu đông, để vào tủ ấm 37ºC trong 3-4h, sau đó lấy ra sẽ chắt được huyết thanh ở phía trên có màu vàng, cho vào eppendorf , nếu có dịch đỏ thì hút riêng rồi đem ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hồng cầu , đánh dấu mẫu rồi bảo quản ở tủ -20ºC.
3.3.8. Phương pháp làm phản ứng ELISA để đánh giá lượng kháng thể của gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB
- Pha loãng mẫu kiểm tra theo tỷ lệ pha loãng của nhà sản xuất sau đó mỗi mẫu được nhỏ vào số giếng cần thiết rồi đem ủ trong điều kiện thích hợp. - Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Kháng thể kháng gà cộng hợp với enzym được bổ sung vào các giếng sau đó ủ trong điều kiện thích hợp.
- Rửa: mẫu được loại bỏ ra khỏi đĩa, và mỗi giếng được rửa kỹ.
- Bổ sung cơ chất có chứa chất tạo màu làm thay đổi màu hiện tại của enzym, đem ủ trong điều kiện thích hợp.
- Cuối cùng bổ sung chất dừng phản ứng.
- Màu của phản ứng được xác định bằng đo mật độ quang học (OD) của mỗi giếng.
- Tỷ lệ mẫu dương tính (Sample to Positive (S/P) ratio) cho mỗi mẫu kiểm tra