Phần 4 Kết quả, thảo luận
4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng sau khi tách dòng
KHI TÁCH DÒNG
Khi đã xác định được giếng chứa tế bào tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu, chúng tơi tiến hành tách dịng các tế bào này. Trong cùng một giếng tế bào, có thể có các nhóm tế bào tiết kháng thể đơn dòng sinh trưởng đồng thời với các nhóm tế bào khơng tiết kháng thể đơn dòng. Do vậy, việc tách dòng các tế bào này sẽ giúp hiệu giá kháng thể cao hơn.
Sau 3 - 4 ngày tách dịng, có thể quan sát rõ các nhóm tế bào trong giếng nuôi cấy. Chọn lọc các giếng chỉ có một nhóm tế bào duy nhất để đánh giá hiệu giá bằng phương pháp ELISA (sử dụng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA).
Chọn lọc dịng tế bào sinh kháng thể có tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Để khẳng định tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng kháng progesterone của 5 dòng tế bào thu được ở trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp ELISA.
Bảng 4.8. Kết quả 5 dịng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO
Tên Dòng Progesterone 3 - CMO BSA
2E4C5 1.109 0.054 2E4F6 1.135 0.049 2E4G8 1.352 0.056 2E7D2 1.104 0.052 2E7H6 1.204 0.051 ĐC (-) 0.050 0.052
Bảng 4.8 cho thấy, 5 dòng tế bào lai (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO. Từ 5 dòng tế bào này, chúng tôi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản.
Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của kháng thể đơn dịng với kháng ngun và các chất khác có cấu trúc phân tử tương tự như progesterone và có trong huyết thanh là hormone steroid như progesterone, estradiol, pregnenolon. Ngoài progesterone trong máu động vật cịn có hormone steroid trên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone. Chúng tơi dùng kháng thể đơn dịng mới thu được lần lượt thử nghiệm với đại diện các nhóm kháng nguyên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone nói trên và thu được kết quả qua bảng 4.9 như sau:
Bảng 4.9. Tính đặc hiệu của kháng thể đơn dịng do 5 dòng tế bào tạo ra STT Dòng
tế bào
Kháng nguyên
Progesterone Estradiol Pregnenolon
1 2E4C5 + - - 2 2E4F6 + + - 3 2E4G8 + - + 4 2E7D2 + - + 5 2E7H6 + + - (+) dương tính; (-) âm tính
Kết quả bảng 4.9 cho thấy:
- Các dòng tế bào 2E4G8 và 2E7D2 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, pregnenolon.
- Dòng tế bào 2E4F6, 2E7H6 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, estradiol.
- Dịng tế bào 2E4C5 cho kết quả dương tính với progesterone và âm tính với Estradiol, pregnenolon. Kháng thể do dịng tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu cao, chúng phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone và chỉ kháng đặc hiệu với progesterone.
- Kháng thể do 4 dòng (2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu khơng cao, không phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone với các dạng hormone gần giống với chúng.
- Kháng thể đơn dịng là kháng thể chỉ có khả năng kết hợp đặc hiệu với một loại kháng nguyên duy nhất mà không kết hợp với các loại kháng nguyên khác cho dù chúng có cấu tạo hóa học gần giống với kháng nguyên đó.
Một dịng tế bào có chất lượng cao ngồi khả năng sinh kháng thể có tính đặc hiệu cao cần phải có sức sống tốt, khả năng sinh kháng thể nhiều, từ đó mới đảm bảo tạo được một lượng lớn kháng thể trên quy mô công nghiệp, đủ để phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế.
Dựa vào kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và khả năng phát triển của 5 dịng tế bào, chúng tơi chỉ chọn dịng 2E4C5 có tính đặc hiệu cao, tiếp tục nhân ni và thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Ni tơ lỏng và gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao.
4.5. NHÂN GIỐNG TẾ BÀO
Từ giếng chứa dòng tế bào tách dịng, chúng tơi tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột. Để bảo quản được tế bào trong thời gian dài, chúng tôi tiến hành cất giống tế bào và bảo quản trong Ni tơ lỏng. Khi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào đã bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai ni cấy thì tiến hành cất giống tế bào.
Tế bào lai khi mới chuyển ra đĩa, chai nuôi mới
Tế bào lai sau 36h nuôi cấy
Tế bào lai sau 72h ni cấy
Hình 4.3. Tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau Nhân giống tế bào đã được trình bày ở phần phương pháp. Từ đĩa 24 giếng Nhân giống tế bào đã được trình bày ở phần phương pháp. Từ đĩa 24 giếng có 1ml mơi trường DMEM 10% hỗn dịch tế bào được ni trong tủ ấm có bổ sung CO2. Sau 3 đến 5 ngày lượng tế bào ở các giếng của đĩa 24 giếng được nhân lên về số lượng và đạt 90 đến 100% bề mặt đĩa.
Tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa 6 giếng có sẵn 3ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 4 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T25 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 3 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T75 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Hình 4.3 tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau ta thấy: Lúc tế bào lai mới được chuyển qua đĩa, chai ni cấy mới thì tế bào lai nằm rải rác chiếm diện tích 5% bề mặt đáy chai nuôi cấy, sau 36h nuôi cấy, tế bào lai được nuôi dưỡng, sinh sản, phát triển nhanh chóng chiếm diện tích 40 - 50 % bề mặt đáy chai nuôi cấy, sau 72h nuôi cấy tế bào lai đã bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai ni cấy, lúc này có thể sử dụng cho thí nghiệm tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột.
4.6. GÂY BÁNG CHO CHUỘT
Kháng thể đơn dịng có thể thu nhận từ dịch nổi của chai nuôi tế bào lai. Theo Karsten và Rudloph, 1985 thì ta có thể thu nhận được kháng thể cao hơn từ 100 đến 1000 lần nếu tiêm các tế bào lai vào xoang bụng của chuột, tiêm pristane. Sau khoảng 7 - 12 ngày thì thu dịch báng.
Trong thí nghiệm này, thực hiện tiêm tế bào lai 2E4C5 vào xoang bụng của chuột đã được trình bày ở phần phương pháp, sau 10 ngày bụng chuột có báng to lên thì ta thu dịch báng. Đã gây báng thành công được 3 chuột (chuột AA1, chuột AA6, chuột AA8 trên tổng số 10 chuột). Kết quả thu được sau mỗi lần lấy dịch báng ở chuột là 6ml/con/lần, từ 3 - 5 lần/con.