Phần 3 Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu
3.3.4.Phương pháp tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.4.Phương pháp tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
Ba ngày sau lần gây miễn dịch cuối cùng với FIA, chuột được gây mê bằng Chloroform, sát trùng chuột bằng cồn 700, tiến hành thu hạch lách và hạch bẹn của chuột.
Quy trình tạo dịng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng được thực hiện theo phương pháp của Köhler và Milstein (Köhler and Milstein, 1975). Tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào lympho B được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:10, sau đó ly tâm tế bào ở tốc độc 1000 vòng/phút trong 5 phút và thu cặn tế bào. Nhỏ 0,3 ml dung dịch PEG 50% (M.W. 1450; Sigma) vào cặn tế bào và ủ 60 giây ở nhiệt độ phịng, sau đó bổ sung tiếp 10 ml môi trường tế bào DMEM (Invitrogen) vào, ly tâm tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút và thu cặn tế bào. Sau khi loại bỏ dịch nổi và hoàn nguyên cặn tế bào trong môi trường chọn lọc DMEM có bổ sung HAT (Hypoxanthine Aminopterin
Thymidine), 150 µl dung dịch tế bào sẽ được đưa vào mỗi giếng trên đĩa 96
giếng và ủ trong tủ ấm 37oC. Sau 10 ngày, loại bỏ dịch nuôi cấy tế bào và thêm vào mỗi giếng 150 µl mơi trường chọn lọc DMEM có bổ sung HT (Hypoxanthine Thymidine). Sau 2 - 4 ngày, tiến hành kiểm tra khả năng tiết kháng thể đơn dòng của các dòng tế bào lai bằng phản ứng ELISA để sàng lọc các tế bào dương tính.
Nghiền nhỏ hạch bẹn, hạch lách chuột
Chia tế bào đã dung hợp ra đĩa nuôi tế bào 96 giếng
Hình 3.2. Dung hợp tế bào ra đĩa ni cấy 3.3.5. Phương pháp sàng lọc tế bào và tách dòng 3.3.5. Phương pháp sàng lọc tế bào và tách dòng
* Sàng lọc tế bào tiết kháng thể đơn dịng bằng phản ứng ELISA
Pha lỗng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate. Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất. Dùng pipet 8 kênh cho 100µl kháng ngun đã pha lỗng vào mỗi giếng của đĩa ELISA.
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa ni cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dịng ra, nếu khơng có đủ mơi trường ni, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút. Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl H2SO4 để làm dừng phản ứng.
Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm. Những giếng có hiệu giá kháng thể cao sẽ cho giá trị cao. Từ kết quả này sẽ chọn ra một số giếng có hiệu giá cao nhất để đánh giá tiếp.
* Sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA
Sau khi sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA bằng phương pháp ELISA. Ở lần sàng lọc này chỉ chọn những giếng có tế bào lai và có kết quả tốt nhất ở lần 1. Tuy nhiên, khi bố trí thí nghiệm sẽ gắn kháng nguyên song song giữa kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên BSA.
Pha loãng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate và chuẩn bị BSA để đạt nồng độ 2µg/ml trong PBS1x. Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất. Dùng pipet đa kênh cho 100µl kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA.
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha lỗng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa nuôi cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dịng ra, nếu khơng có đủ mơi trường ni, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0,5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho
vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút.
Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl H2SO4 để làm dừng phản ứng. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm. Những giếng có kết quả tốt nhất là những giếng có hiệu giá kháng thể cao với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO nhưng không đặc hiệu cho BSA.
* Tách dòng
Sau khi kiểm tra khả năng tạo kháng thể bằng ELISA, ta biết được giếng nào có kháng thể, tuy nhiên đây là kháng thể đa dòng do nhiều tế bào lai tạo thành. Để có kháng thể đơn dịng ta phải tiến hành tách dòng như sau:
- Cột đầu tiên của đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng cho 150µl mơi trường DMEM, các giếng còn lại cho 100µl mơi trường DMEM được trình bày bố trí thí nghiệm ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sơ đồ thí nghiệm tách dòng tế bào lai
1 2 3 4 5 6
A 150µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl
B 150µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl
C 150µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl
- Dùng pipet 200µl trộn đều giếng có tế bào tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu, hút 50µl từ giếng này sang giếng đầu tiên của đĩa tách dòng (giếng A1). Trộn đều, lấy 50µl từ giếng A1 sang giếng B1, rồi lần lượt đến hết các giếng trong hàng số 1 của đĩa. Dùng pipet đa kênh trộn đều dịch tế bào trong hàng đầu tiên, chuyển 50µl từ hàng 1 sang hàng 2. Tiếp tục trộn đều và chuyển cho đến hàng cuối cùng của đĩa.
- Chuyển tế bào pha lỗng sang ni trong các giếng đã có tế bào ni sau đó chuyển vào ni trong tủ ấm CO2 ở điều kiện tiêu chuẩn.
- Thay môi trường cho tế bào 2 ngày 1 lần.
- Sau khi tế bào phát triển tốt (gần kín đáy), kiểm tra lại hiệu giá kháng thể. Chọn ra giếng có hiệu giá kháng thể cao nhất nhân lên với liều lượng lớn để bảo quản hoặc tiêm vào ổ bụng chuột, thu dịch báng.
3.3.6. Nhân giống tế bào
Từ giếng chứa dòng tế bào tách dòng, tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột.
Chuẩn bị đĩa 24 giếng có sẵn 1ml mơi trường DMEM 10% trong mỗi giếng. Dùng pipet trộn đều để làm bong các tế bào khỏi đáy giếng. Chuyển toàn bộ dịch tế bào sang các giếng trong đĩa 24 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC có bổ sung CO2. Sau 3 - 5 ngày, lượng tế bào trong các giếng của đĩa 24 giếng đạt 90 - 100% bề mặt, tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa 6 giếng.
Quy trình cũng tương tự như trên: Chuẩn bị đĩa 6 giếng có sẵn 3ml môi trường DMEM 10% FBS. Dùng pipet trộn đều để làm bong tế bào và chuyển dịch sang các giếng trong đĩa 6 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC có bổ sung CO2.
Sau 2 - 4 ngày, cấy chuyển tiếp các tế bào sang chai T25: Chuẩn bị chai nuôi cấy tế bào T25 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS. Dùng pipet trộn đều để làm bong tế bào và chuyển dịch sang các chai T25. Nuôi tế bào trong tủ ấm 370C có bổ sung CO2. Sau 2 - 3 ngày, cấy chuyển tiếp các tế bào sang chai T75.
Để bảo quản được tế bào trong thời gian dài, chúng tôi tiến hành cất giống tế bào và bảo quản trong ni tơ lỏng.
Lắc mạnh chai nuôi cấy để các tế bào bong hết khỏi đáy. Chuyển dịch chứa tế bào sang ống corning 50ml. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dịch sau ly tâm sang ống khác để kiểm tra hiệu giá hoặc loại bỏ. Trộn tế bào trong 5ml môi trường cất giống tế bào, sau đó chuyển 1.5ml vào mỗi ống bảo quản tế bào. Bổ sung 20ml môi trường nuôi cấy vào các chai nuôi tế bào vừa được cất giống. Đặt ống bảo quản trong hộp nhựa để qua đêm ở -70oC (làm lạnh 1-2 oC mỗi phút). Các tế bào đã đóng băng được bảo quản trong bình nitơ lỏng. 3.3.7. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng
- Tiêm cho chuột BALb/c khỏe mạnh, khơng có chửa, 6 tuần tuổi 0,5ml pristine (2,6,10,14-tetramethyldecanoic acid) hoặc dung dịch FIA (Freund's incomplete adjuvant ) vào xoang bụng chuột.
- Sau 7 ngày, tiến hành tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột.
- Nhân giống các tế bào ra chai T75 trước khi tiêm xoang bụng 3 - 4 ngày. - Lắc mạnh chai nuôi cấy tế bào để các tế bào bong khỏi đáy. Chuyển toàn bộ dịch này sang ống corning 50 ml. Ly tâm 1000 vòng trong 5 phút ở nhiệt độ thường.
- Bổ sung môi trường vào ống và trộn đều.
- Sau 10 ngày, khi quan sát thấy bụng chuột căng phồng thì tiến hành thu dịch báng trong xoang bụng.
- Sau khi thu, cần ly tâm dịch ở 1000 vòng trong 5 phút để loại bỏ cặn tế bào, hồng cầu lẫn trong dịch.
Hình 3.3. Tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột
Hình 3.4. Thu dịch báng xoang bụng chuột
3.3.8. Phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng Nguyên tắc của phương pháp ELISA: Kháng thể đơn dòng đặc hiệu sẽ kết Nguyên tắc của phương pháp ELISA: Kháng thể đơn dòng đặc hiệu sẽ kết hợp với kháng nguyên là protein tái tổ hợp SEB. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể này sẽ được phát hiện thông qua một kháng thể cộng hợp (conjugate) đặc hiệu loài gắn enzyme và một cơ chất hiện màu.
Các bước tiến hành như sau:
- Gắn (coating) đĩa ELISA với 100 µl kháng nguyên Progesterone 3 - CMO qua đêm ở nồng nồng độ thích hợp. Rửa đĩa ELISA đã được gắn kháng nguyên bằng dung dịch rửa (PBS + 0,05% Tween 20) để loại bỏ những kháng nguyên không gắn vào bề mặt bản.
- Che chắn (blocking) đĩa ELISA bằng 300 µl dung dịch rửa có bổ sung 5% sữa loại bơ (Skim milk), ủ đĩa ELISA trong 1 h ở 37oC. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho kháng thể đơn dòng (là dịch nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể) vào, 100 µl/giếng. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 1 h. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho 100 µl/giếng kháng thể cộng hợp (Horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG, Invitrogen) đặc hiệu loài gắn enzyme vào. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 1h. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho 100 µl/giếng dung dịch cơ chất hiện màu TMB. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 10 phút, dừng phản ứng bằng H2SO4.
PHẦN 4. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHÁP ELISA
Số lượng chuột BAL b/c là 8 con, chia làm 4 lơ thí nghiệm và gây miễn dịch. Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột theo quy trình gây miễn dịch đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tôi tiến hành lấy máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể tức là khả năng sinh kháng thể kháng progesterone.
Để tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần có kháng nguyên đã biết, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tác dụng của enzyme. Đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học tương ứng với bước sóng của màu thể hiện.
Kết quả phản ứng ELISA được trình bày ở bảng 4.1 là kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm.
Bảng 4.1. Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm Lơ thí nghiệm I II III IV Chuột số 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml) 50 50 100 100 200 200 300 300 Giá trị OD trung bình (n=11) 0,411± 0,021 0,699± 0,012 0,505± 0,024 0,752± 0,025 1,144± 0,022 1,107± 0,031 0,540± 0,027 0,534± 0,036 Đối chứng (-) 0,053
Trong các thí nghiệm thực hiện trên, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB. Enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, dừng phản ứng bằng H2SO4 thì màu vàng xuất hiện. Bước sóng hấp thụ của màu tương ứng là 630 ŋm.
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy:
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha lỗng với nồng độ 50µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm I, chuột số 1 là 0,411±0,021, chuột số 2 là 0,699±0,012.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha lỗng với nồng độ 100µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm II, chuột số 3 là 0,505±0,024, chuột số 4 là 0,752±0,025.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 200µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm III, chuột số 5 là 1,144±0,022, chuột số 6 là 1,107±0,031.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 300µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm IV, chuột số 7 là 0,540±0,027, chuột số 8 là 0,534±0,036.
Giá trị OD phản ánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của chuột. Giá trị OD càng nhỏ chứng tỏ hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng ít và ngược lại giá trị OD càng lớn thì hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng cao. Với giá trị OD≤0,053 được coi là khơng có kháng thể.
Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm cho thấy:
- Gây miễn dịch cho chuột với hàm lượng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO khác nhau sẽ cho các đáp ứng miễn dịch khác nhau.
- Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt nhất (giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 3 cao hơn giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 1, lô 2, lô 4).
- Cùng lượng kháng nguyên 200µg/ml Progesterone 3 - CMO nhưng chuột