Phần 4 Kết quả, thảo luận
4.1. Đánh giá kết quả gây đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp elisa
PHÁP ELISA
Số lượng chuột BAL b/c là 8 con, chia làm 4 lơ thí nghiệm và gây miễn dịch. Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột theo quy trình gây miễn dịch đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tơi tiến hành lấy máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể tức là khả năng sinh kháng thể kháng progesterone.
Để tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần có kháng nguyên đã biết, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tác dụng của enzyme. Đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học tương ứng với bước sóng của màu thể hiện.
Kết quả phản ứng ELISA được trình bày ở bảng 4.1 là kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm.
Bảng 4.1. Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm Lơ thí nghiệm I II III IV Chuột số 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml) 50 50 100 100 200 200 300 300 Giá trị OD trung bình (n=11) 0,411± 0,021 0,699± 0,012 0,505± 0,024 0,752± 0,025 1,144± 0,022 1,107± 0,031 0,540± 0,027 0,534± 0,036 Đối chứng (-) 0,053
Trong các thí nghiệm thực hiện trên, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB. Enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, dừng phản ứng bằng H2SO4 thì màu vàng xuất hiện. Bước sóng hấp thụ của màu tương ứng là 630 ŋm.
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy:
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 50µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm I, chuột số 1 là 0,411±0,021, chuột số 2 là 0,699±0,012.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 100µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm II, chuột số 3 là 0,505±0,024, chuột số 4 là 0,752±0,025.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 200µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm III, chuột số 5 là 1,144±0,022, chuột số 6 là 1,107±0,031.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha lỗng với nồng độ 300µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm IV, chuột số 7 là 0,540±0,027, chuột số 8 là 0,534±0,036.
Giá trị OD phản ánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của chuột. Giá trị OD càng nhỏ chứng tỏ hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng ít và ngược lại giá trị OD càng lớn thì hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng cao. Với giá trị OD≤0,053 được coi là khơng có kháng thể.
Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm cho thấy:
- Gây miễn dịch cho chuột với hàm lượng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO khác nhau sẽ cho các đáp ứng miễn dịch khác nhau.
- Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt nhất (giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 3 cao hơn giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 1, lơ 2, lơ 4).
- Cùng lượng kháng ngun 200µg/ml Progesterone 3 - CMO nhưng chuột số 5 có giá trị OD là 1,144±0,022, chuột số 6 có giá trị OD là 1,107±0,031.
Có thể đưa ra nhận xét là đáp ứng miễn dịch của cơ thể phụ thuộc vào lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể chuột và đáp ứng miễn dịch cũng phụ thuộc vào từng cá thể.
Trên cơ sở kết quả đáp ứng miễn dịch, chuột số 5 và chuột số 6 ở lơ thí nghiệm III có đáp ứng miễn dịch tốt khi dùng kháng nguyên với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO. Vì vậy chúng tơi dùng nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO thích hợp nhất để gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm nhằm thu được những cá thể chuột có đáp ứng miễn dịch tốt nhất.
Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO, chúng tôi tiếp tục tiến hành gây miễn dịch cho 3 chuột cái BAL b/c thuần chủng khác theo quy trình gây miễn dịch đã trình bày ở phần phương pháp. Tiến hành lấy mẫu máu, tách huyết thanh để kiểm tra đáp ứng miễn dịch của từng chuột bằng phản ứng ELISA. Chuột nào có đáp ứng miễn dịch tốt nhất sẽ được chọn để thu lấy tế bào lympho B cho quá trình lai tế bào sau này.
Đây là bước lựa chọn các cá thể chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất, từ đó thu lấy tế bào lympho B phục vụ cho bước lai tế bào sau này. Bước này rất quan trọng vì nếu chúng ta chọn chính xác cá thể có đáp ứng miễn dịch tốt, sinh nhiều kháng thể thì sẽ nâng cao chất lượng tế bào lympho B, từ đó tăng hiệu quả lai tế bào.
Kết quả phản ứng ELISA đo ở bước sóng 630 ŋm bằng máy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể đặc hiệu progesterone được trình bày ở bảng 4.2 là sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu Progesterone trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone 3 - CMO.
Bảng 4.2. Mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone 3 - CMO
STT Mẫu kiểm tra Giá trị OD (n=3)
1 Chuột A 1,042 ± 0,036
2 Chuột B 1,106 ± 0,046
3 Chuột C 1,152 ± 0,03
4 Đối chứng (-) BSA 0,1% 0,051
BSA: BovineSerumAlbumin
Giá trị OD phản ánh nồng độ kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật độ quang học càng nhỏ chứng tỏ lượng kháng thể được giữ lại càng ít và điều này cũng chứng tỏ rằng lượng kháng thể được giữ lại ít, ngược lại mật độ quang học càng lớn chứng tỏ lượng kháng thể được giữ lại càng nhiều và kéo theo hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng nhiều.
Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy:
- Với giá trị OD ≤ 0,051 được coi là khơng có kháng thể.
- Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO được tiêm cho 3 chuột cái, lại cho kết quả khác nhau cho ta thấy khả năng đáp ứng miễn dịch ở các cá thể chuột khác nhau là khác nhau.
- Trong các mẫu huyết thanh thu từ 3 chuột đều cho giá trị OD cao, chứng tỏ 3 chuột thí nghiệm đều có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt. Do đó với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO là phù hợp.
- Mẫu huyết thanh của chuột A có giá trị OD thấp nhất (1,042) và mẫu huyết thanh của chuột C có giá trị OD cao nhất (1,152). Từ kết quả này cho ta thấy hàm lượng kháng thể kháng progesterone trong huyết thanh của chuột A là thấp nhất và hàm lượng kháng thể kháng progesterone trong huyết thanh của chuột C là cao nhất.
Như vậy, đáp ứng miễn dịch không chỉ phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên đưa vào cơ thể mà còn phụ thuộc vào cá thể động vật. Mặc dù tiếp nhận cùng một lượng kháng nguyên như nhau thì mỗi cá thể động vật có đáp ứng miễn dịch khác nhau, nồng độ kháng thể trong huyết thanh cũng khác nhau. Kết quả đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào hai yếu tố chính như sau:
+ Nồng độ kháng nguyên đưa vào cơ thể.
+ Cùng nồng độ kháng nguyên đưa vào thì mỗi cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Dựa vào kết quả đáp ứng miễn dịch, chuột C có đáp ứng miễn dịch tốt nhất nên được lựa chọn để lấy tế bào Lympho B và dung hợp với tế bào Myeloma nhằm thu được tế bào lai sinh kháng thể đơn dịng có chất lượng cao.
4.2. Kết quả lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone.
Để tạo được dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dịng kháng progesterone, chúng tơi tiến hành lai tế bào Myeloma Sp2/0 với tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên.
Tế bào Myeloma Sp2/0 là tế bào ung thư tủy của chuột dịng BAL b/c. Ở điều kiện ni cấy invitro thích hợp, tế bào sản sinh và phát triển rất nhanh, có
địi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ mơi trường. Để có được tế bào Myeloma khỏe mạnh và sẵn sàng trong việc dung hợp tế bào thì mơi trường có bổ sung 10% FBS là thích hợp và mơi trường ni cấy được tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần. Hình 4.1 là hình ảnh tế bào Myeloma được phục hồi ở các thời gian khác nhau.
Tế bào Myeloma khi mới phục hồi Tế bào Myeloma sau 24h phục hồi
Tế bào Myeloma sau 72h phục hồi
Hình 4.1. Tế bào Myeloma được phục hồi ở các thời gian khác nhau Tế bào Myeloma lúc đầu mới phục hồi độ phủ bám trên đĩa chưa nhiều, Tế bào Myeloma lúc đầu mới phục hồi độ phủ bám trên đĩa chưa nhiều, sau 72h tế bào sinh sản và phát triển nhanh, độ phủ bám trên đĩa đã gần như kín hết mặt đĩa.
Sau khi tiến hành dung hợp hai loại tế bào trên, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc HAT và HT, chúng tơi tiến hành kiểm tra tồn bộ số giếng dưới kính
hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai. Hình 4.2 là hình ảnh tế bào lai hybridoma thu được ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau.
Tế bào lai 5 ngày tuổi Tế bào lai 7 ngày tuổi
Tế bào lai 10 ngày tuổi Tế bào lai 13 ngày tuổi (sau khi thay môi trường HAT bằng mơi trường HT) Hình 4.2. Tế bào lai hybridoma thu được ở các
thời điểm nuôi cấy khác nhau
Tế bào lai được nuôi dưỡng bằng môi trường HAT, lúc 5 ngày tuổi tập trung thành đám nhỏ, sau 10 ngày tuổi đã sinh sôi, phát triển nhanh chiếm diện tích 70 - 80% bề mặt đĩa. Đến khi tế bào lai 13 ngày tuổi thay môi trường nuôi dưỡng HAT bằng mơi trường HT soi dưới kính hiển vi thì các tế bào lai này được phân bố khắp mặt đĩa nuôi cấy, sinh sản và phát triển rất nhanh.
Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành 3 đợt thí nghiệm khác nhau để sản xuất tế bào lai hybridoma tiết kháng thể đơn dịng. Mỗi đợt thí nghiệm, sau
khi lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào trên 8 đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng và kết quả được trình bày trong bảng 4.3 kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào Lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Bảng 4.3. Kết quả lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên
progesterone 3 - CMO Lần lai (fusion) Số lượng tế bào dùng để lai Số đĩa nuôi cấy tế bào dùng (đĩa 96 giếng) Tổng số giếng nuôi cấy tế bào Tổng số giếng có tế bào lai Tỷ lệ % số giếng có tế bào lai/giếng ni cấy tế bào Tế bào Myeoloma Tế bào lympho B 1 2 x 107 2 x 108 8 768 740 96,35 2 2 x 107 2 x 108 8 768 696 90,63 3 2 x 107 2 x 108 8 768 728 94,79
Sử dụng tế bào Myeloma với số lượng 2 x 107 lai với tế bào Lympho B 2 x 108 với tổng số giếng nuôi cấy tế bào là 768 giếng qua 3 lần lai tạo.
Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ lai tạo thành công tế bào lai là rất cao, tỷ lệ các giếng ni cấy có tế bào lai giao động từ 90,63 - 96,35% với số đĩa nuôi cấy tế bào dùng là 8 đĩa trên đĩa 96 giếng.
Cụ thể:
- Lần lai thứ nhất có 740/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 96,35%.
- Lần lai thứ hai có 696/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 90,63% - Lần lai thứ ba có 728/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 94,79%. Ở lần lai thứ nhất cho kết quả cao nhất với 740/768 giếng có tế bào lai, đạt 96,35%.
Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào Lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone 3 - CMO cho thấy tỷ lệ % số giếng có tế bào lai trên số giếng ni cấy tế bào thì lần lai thứ nhất có kết quả cao nhất so với lần lai thứ hai và lần lai thứ ba.
4.3. KẾT QUẢ SÀNG LỌC KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG
Ni cấy tế bào bằng môi trường HT 2 - 4 ngày. Tiến hành kiểm tra khả năng tiết kháng thể đơn dòng của các tế bào lai để sàng lọc các tế bào dương tính. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm.
Để sàng lọc được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng mong muốn, dịch ni cấy tế bào của tất cả các giếng có tế bào lai đã được thu nhận và được dùng cho phản ứng ELISA. Trong nghiên cứu này kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho chuột cũng như dùng để gắn bản ELISA (200µg/giếng) là Progesterone 3 - CMO.
Điều này cũng có nghĩa là sẽ có 3 khả năng xảy ra đối với tế bào lai được sinh ra, bao gồm:
(1)tế bào lai được tạo ra nhưng khơng tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu. (2)tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 – CMO.
(3)tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên gắn bản BSA. Để sàng lọc và thu nhận được đúng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, hai loại kháng nguyên là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA đã được sử dụng một cách riêng rẽ để gắn bản ELISA.
Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng bằng phản ứng ELISA được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên bằng phản ứng ELISA
Lần lai (fusion) Tổng số giếng kiểm tra Kết quả phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên gắn bản là Progesterone 3 - CMO Sử dụng kháng nguyên gắn bản BSA
Số giếng cho kết quả dương tính với Progesterone 3 - CMO mà khơng dương tính với kháng nguyên là BSA Số giếng dương tính Tỉ lệ % Số giếng dương tính Tỉ lệ % Số giếng dương tính Tỉ lệ % 1 740 5 0,64 5 0,64 0 0 2 696 14 2,01 14 2,01 0 0 3 728 22 3,02 20 2,74 2 (2E4, 2E7)* 0,27
*2E4, 2E7 là ký hiệu tên của hai dịng tế bào lai cho kết quả dương tính với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO mà khơng dương tính với kháng ngun BSA.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.4 cho thấy, có 2 dịng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Ở lần lai thứ nhất có 5/740 giếng (0,64%) cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA.
Lần lai thứ 2 có 14/696 giếng (2,01%) cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA.
Đối với lần lai thứ 3 thì có 22/728 giếng (3,02%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, trong khi chỉ có 20/728 giếng (2,74%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA, điều này cũng có nghĩa là trong số 22 giếng cho kết quả ELISA dương tính thì 20/22 (90,91%) giếng có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone 3 - CMO và chỉ có 2/22 (9,09%) giếng có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone 3 - CMO mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Như vậy sau 3 lần lai chúng tôi đã lai tạo thành công 2 giếng (2E4, 2E7) hybridoma tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu. Những giếng có hiệu giá kháng thể