Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3.6.Kháng thể đơn dòng
2.3. Một số hiểu biết về miễn dịch học
2.3.6.Kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng
Trong cuộc sống, cơ thể sinh vật luôn luôn bị đe dọa bởi các tác nhân gây bệnh và các tác nhân có hại khác (tác nhân lạ) do vậy cơ thể ln phải có sự thích ứng đa dạng để bảo vệ mình. Q trình phản ứng của cơ thể nhận ra và loại trừ chúng ra khỏi cơ thể được gọi là quá trình đáp ứng miễn dịch. Các imunoglobin (có bản chất glycoprotein) do các tế bào lympho B cũng như tương bào (biệt hoá từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vơ hiệu hố các tác nhân lạ như: vi khuẩn hoặc vi rút được gọi là kháng thể.
Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ được đại thực bào tiếp nhận phân chia thành các quyết định kháng nguyên (epitope). Một kháng nguyên có thể có một hay nhiều epitope. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (tế bào lympho B và lympho T) khác nhau lại phản ứng khác nhau với cùng một loại epitope và cho ra các loại kháng thể khác nhau. Cũng vì vậy, một loại kháng nguyên xâm nhập cơ thể, đáp ứng miễn dịch của cơ thể sẽ sản xuất ra nhiều loại kháng thể khác nhau, được gọi là kháng thể đa dòng hay một họ kháng thể.
Nếu chọn ra một tế bào (H) có khả năng tổng hợp ra kháng thể kháng kháng ngun có tính đặc hiệu và ái lực KN - KT cao, nhân nó lên thành tập hợp của nhiều tế bào có cùng một nguồn gốc là một tế bào ban đầu, tạo thành dịng tế bào (H), thì kháng thể do dịng tế bào này tạo ra cũng sẽ có tính đặc hiệu và ái lực KN - KT cao. Kháng thể do dòng tế bào này tạo ra được gọi là kháng thể đơn dòng (KTĐD).
Sản xuất kháng thể đơn dịng theo cơng nghệ Hybridoma
Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn dịng theo cơng nghệ hybridoma là sự dung hợp giữa tế bào lympho B sản sinh kháng thể với tế bào myeloma bất tử.
Theo đó, tế bào B sau khi được kích thích do tiếp xúc với kháng nguyên, chúng sẽ biệt hóa thành các tế bào plasma để sản xuất kháng thể. Tuy nhiên tế bào plasma là tế bào ở giai đoạn tận cùng của q trình biệt hóa, vì vậy chúng không thể tiếp tục nhân lên được nữa. Do đó, để có được dịng tế bào vừa có khả năng sinh sản vừa có khả năng sản xuất kháng thể, người ta phải lai tế bào ung thư tủy Myeloma với tế bào miễn dịch sinh kháng thể. Thông thường, kháng thể đơn dòng được tạo ra nhờ sự dung hợp tế bào Myeloma với tế bào lá lách của chuột đã được gây miễn dịch bằng kháng nguyên mong muốn. Tuy nhiên, các cải tiến hiện nay đã cho phép sử dụng tế bào lympho B của chuột hamsters, gà và thỏ (Speiker Polet et al., 1995).
Qui trình tạo kháng thể đơn dịng gồm các bước sau:
Tạo các tế bào sinh kháng thể: Tiêm kháng nguyên để gây miễn dịch cho
chuột thuần chủng dòng BAL b/c. Dưới tác dụng của kháng nguyên, các tế bào lympho B ở lách và các hạch sẽ được kích thích mẫn cảm và sản xuất kháng thể.
Tạo các tế bào lai: Khi đã có các nguyên liệu cần thiết thì tiến hành dung
hợp tạo tế bào lai. Tế bào lympho B được trộn với tế bào Myeloma theo một tỉ lệ thích hợp. Sau đó bổ sung thêm yếu tố thúc đẩy dung hợp PEG (Polyethylen Glycol, thường dùng loại có trong lượng phân tử 1500) vào dịch huyền phù để dung hợp tế bào.
Nuôi cấy và chọn lọc các tế bào lai: Để có thể chọn được các tế bào lai
người ta phải dùng các thể đột biến của tế bào myeloma. Các thể đột biến này khơng có khả năng tổng hợp enzyme hypoxanthin phosphoribosyltransferase được gọi là các thể đột biến HPRT- (các dòng đột biến được dùng nhiều là SP2/0 hoặc P3-X63.Ag8). Nhờ có các thể đột biến này mà ta có thể chọn được các tế bào lai trong môi trường chọn lọc HAT. Đây là loại mơi trường ni cấy tế bào (ví dụ RPMI 1640 hoặc Dulbecko modified MEM) được bổ sung thêm 3 chất Hypoxanthin, Aminopterin và Thymidin.
Năm 1975 Kohler và Milstein đã đưa kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm các bước sau:
Bước 1: Gây miễn dịch;
Bước 2: Dung hợp tế bào lympho đã được gây mẫn cảm với tế bào Myeloma để tạo tế bào lai;
Bước 3: Nuôi cấy và phát triển các tế bào lai trong môi trường chọn lọc và phát triển các dòng tế bào lai sinh sản ra kháng thể mong muốn;
Bước 4: Sản xuất kháng thể đơn dòng invitro và invivo. Nguyên lý của các bước được thực hiện như sau: * Bước 1: Gây miễn dịch
Muốn sản xuất thành cơng kháng thể đơn dịng trước hết địi hỏi cá thể động vật phải được gây miễn dịch tốt với kháng nguyên mong muốn. Số lượng lympho B có khả năng hình thành kháng thể tăng lên sau khi gây miễn dịch là một trong các biểu hiện thành cơng trong q trình sản xuất thành cơng kháng thể đơn dịng.
Gây miễn dịch invivo: Quá trình gây miễn dịch được thực hiện ở động vật đã chọ thường là chuột nhắt trắng thuần chủng. Nhiều sơ đồ gây miễn dịch cho nhiều loại kháng nguyên khác nhau: Đối với kháng nguyên hòa tan, sơ đồ đơn giản nhất là tiêm 0,05 - 0,1 mg kháng nguyên với Freund hoàn chỉnh, mũi thứ hai được thực hiện sau 2 tuần với cùng lượng kháng nguyên. Động vật được lấy máu ở tuần thứ 4 để định lượng kháng thể, nếu con vật nào đó có hàm lượng kháng thể cao sẽ được tiêm nhắc lại vào tĩnh mạch với ½ lượng kháng ngun. Nếu các con vật có lượng kháng thể chưa cao, người ta tiêm nhắc lại lần nữa. Tế bào lách (lympho B mẫn cảm) được thu sau 3 ngày kể từ lần tiêm vào tĩnh mạch.
Gây miễn dịch invitro: Đây là phương pháp gây miễn dịch thích hợp cho q trình sản xuất kháng thể đơn dịng có nguồn gốc từ người hoặc những chất có tính kháng ngun yếu. Tế bào lành được nuôi cấy rồi gây miễn dịch
invitro. Phương pháp này chỉ cần một lượng nhỏ kháng nguyên, thời gian gây
miễn dịch ngắn.
Dịng tế bào ung thư tủy: Có ba điều kiện chủ yếu để chọn dòng tế bào ung thư tủy lai với tế bào lympho đã được gây miễn dịch. Trước tiên tế bào ung thư tủy phải có dấu ấn để kháng aminoprotein nhằm loại trừ tế bào u tủy không dung hợp với môi trường chọn lọc. Thứ hai, tế bào u tủy phải không sản xuất chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Cuối cùng là tế bào u tủy phải khỏe mạnh và ổn định.
* Bước 2: Dung hợp tế bào Lympho đã được gây mẫn cảm với tế bào Myeloma để tạo tế bào lai.
Để thu được tế bào lai (hybridoma) tế bào lympho và tế bào u tủy được trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp. Những thí nghiệm đầu tiên thường dùng virus Sendai để tạo sự kết hợp giữa các tế bào. Sau này người ta thường dùng các chất hóa học
như polyethylen glycol (PEG) để lai các tế bào. So với virus Sendai, PEG làm tăng đáng kể số lượng các tế bào lai, PEG có khả năng tạo nhiều điểm ngưng kết hơn trên bề mặt tế bào lympho B. Nồng độ thích hợp của PEG khoảng 50%. Với nuôi cấy tế bào một lớp PEG có trọng lượng phân tử 1000 Da là tốt nhất, cịn các tế bào ni trong hỗn dịch trọng lượng phân tử 4000 D của PEG có hiệu quả tốt hơn.
Sharon (1980) cho rằng: Tần số tạo các tế bào lai phụ thuộc nhiều vào pH của dung dịch PEG. Số lượng tế bào lai nhận được nhiều nhất khi dung dịch PEG có pH từ 8,2 - 8,4.
PEG có tác dụng làm thay đổi cấu trúc màng tế bào, tạo điều kiện cho 2 tế bào dễ dính và kết hợp với nhau. Thời gian cho các tế bào tiếp xúc với PEG phải vừa đủ (khoảng từ 1 đến 2 phút) để các tế bào ngưng tụ lại với nhau, nhưng không gây tổn thương tế bào. Neuraminidaza đã được dùng để xử lý tế bào trước khi cho dung hợp, có tác dụng làm tăng hiệu suất dung hợp. Theo Norwood thì dimethylsulfoxide có tác dụng tạo sự thuận lợi cho sự liên hợp dưới tác dụng của PEG.
* Bước 3: Nuôi cấy và phát triển các tế bào lai trong môi trường chọn lọc và phát triển các dòng tế bào lai sinh sản ra kháng thể mong muốn.
Có ba mơi trường cơ bản thường được dùng trong quá trình sản xuất kháng thể đơn dịng: Mơi trường RPMI 1640, môi trường Dulbeccos, môi trường Iscoves. Sau khi dung hợp, hỗn dịch tế bào được nuôi trong môi trường chọn lọc HAT. Trong mơi trường này có aminosterin ức chế quá trình tổng hợp AND. Tất cả các tế bào u tủy và các tế bào lách không dung hợp sẽ chết trong vài ngày sau đó. Chỉ có các tế bào lai với hai đặc trưng cần thiết cho sự phát triển trong môi trường chọn lọc sẽ sống và nhân lên. Q trình chọn lọc và hồn tất trong 5 đến 7 ngày sau khi dung hợp, có thể thấy rõ những tế bào lai trên nền các tế bào chết. Nuôi cấy cần được bổ sung thêm mơi trường khi nó chuyển sang màu vàng. Việc này thường được thực hiện bằng cách hút bỏ 20 - 50% môi trường cũ và thay thế mơi trường mới khơng có aminoprotein (mơi trường HT). Sau đó một vài ngày tế bào lai được nuôi cấy bằng môi trường bình thường.
Những ngày đầu phát triển của tế bào lai cần có một số chất hỗ trợ, thường được dùng nhiều nhất là huyết thanh tế bào bê (FCS) và tế bào cuống rốn người (HUCS). FCS thường được dùng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào. Đối với các tế bào lai, thường bổ sung 10 - 20% FCS trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ FCS có thể cho các hoạt tính hỗ trợ sinh trưởng khác nhau, cho nên cần phải thử
nghiệm khả năng hỗ trợ phát triển của mỗi loại FCS. Một số nhà nghiên cứu ưa dùng lớp té bào nuôi cấy các tế bào lai. Chúng là các tế bào của dịch phúc mạc, các tế bào lách, tế bào tuyến ức. Các tế bào này thường được nuôi cấy một vài ngày trước khi dung hợp tế bào.
* Bước 4: Chọn lọc và tạo dòng các tế bào sản xuất kháng thể
Mục đích của việc kiểm tra và sớm định loại các tế bào lai sản xuất kháng thể mong muốn để đỡ tốn cơng sức và ngun liệu duy trì và phát triển các tế bào không cần thiết. Phương pháp kiểm tra sự sản xuất của kháng thể của tế bào cần được định rõ trước khi lai các tế bào. Phương pháp kiểm tra sự sản xuất kháng thể của tế bào cần được định rõ trước khi lai các tế bào. Có rất nhiều thử nghiệm để phát hiện kháng thể trong môi trường nuôi cấy tế bào lai. Tuy nhiên khi chọn thử nghiệm người ta thường quan tâm đến hai điều kiện sau: Trước tiên là bản chất của kháng nguyên dùng phát hiện kháng thể, thứ hai là điều kiện thuận lợi của thử nghiệm (nó cần cho kết quả nhanh và có thể thực hiện hàng ngày). Vì tế bào lai thường phát triển với các tốc độ khác nhau cho nên ELISA là một trong các kỹ thuật được dùng nhiều để phát hiện kháng thể trong kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng, vì nó dễ thực hiện, có độ nhạy cao và có thể kiểm tra một lượng mẫu lớn trong cùng một lúc. Phương pháp này cũng có thể cho biết trực tiếp lớp, phân lớp của kháng thể được phát hiện bằng cách dùng các kháng huyết thanh đặc hiệu.
Kiểm tra các tế bào lai được tiến hành khi các quần thể tế bào lai mọc rõ và tế bào nuôi cấy ngả màu vàng. Các quần thể tế bào dương tính phải được tách dịng để sản xuất ra một loại kháng thể đặc hiệu. Việc tách dòng nhanh còn giúp cho việc tách biệt các tế bào lai dương tính ra khỏi sự phát triển quá mạnh của tế bào lai không sản xuất kháng thể. Trước đây việc tách dòng tế bào lai thường được thực hiện trong lớp thạch mềm, gần đây phương pháp pha loãng tới hạn thường được dùng nhiều hơn. Phương pháp này thực hiện dễ dàng bằng cách pha loãng và phân phối với nuôi cấy tế bào sao cho có một tế bào trong một giếng ni cấy.
Phát hiện tính đặc hiệu của kháng thể đơn dịng:
Những địi hỏi về đặc tính của kháng thể đơn dịng phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu. Đặc tính quan trọng nhất của kháng thể đơn dòng là tính đặc hiệu của chúng. Điều này có thể được thực hiện bằng cách cho kháng thể liên kết các kháng nguyên khác nhau. Đánh giá bằng kỹ thuật ELISA hoặc kỹ thuật thấm miễn dịch với kháng nguyên là protein hoặc các kháng ngun hịa tan. Một số đặc tính quan trọng khác của kháng thể đơn dòng cần được xác định như khả
năng gây kết tủa, ngưng kết,…, lớp và phân lớp Ig điều này có liên quan chặt chẽ với mục đích sử dụng kháng thể.
Nhân nuôi tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng invitro:
Sản xuất kháng thể đơn dịng trong mơi trường nuôi cấy thường dễ hơn và kháng thể sản xuất ra thường tinh khiết. Tuy nhiên phương pháp này chỉ nhận được một hàm lượng nhỏ kháng thể 10 - 100µg/ml. Mơi trường ni cấy phải dùng hệ thống ống hút liên tục để hút 80 - 90% môi trường nuôi cấy khi ngả vàng hoặc phải dùng một lượng lớn chai nuôi cấy tế bào và gạt khi tế bào chết. Ngoài ra FCS trong môi trường nuôi cấy là nguồn nhiễm các immunoglobulin không đặc hiệu. Để khắc phục những nhược điểm này đã có một phương pháp loại trừ kháng thể khơng đặc hiệu trong FCS trước khi bổ sung vào mơi trường ni cấy. Thêm vào đó nhiều mơi trương ni cấy khơng có huyết thanh dùng cho kỹ thuật lai tế bào đã được sử dụng.
Tinh chế kháng thể đơn dòng: Mặc dù kháng thể đơn dòng có thể dùng khơng cần tinh chế, nhưng q trình tinh chế vẫn được thực hiện phụ thuộc vào mục đích sử dụng. Điều quan trọng là phải biết lớp hoặc phân lớp kháng thể vì khơng phải tất cả các lớp kháng thể đều gắn với protein A. IgG2a và IgG2b và IgG3 của chuột gắn tốt với protein A nhưng IgG1, Ig2, IgM không gắn. Kỹ thuật này ưu điểm hơn phương pháp ái lực trên cột sepharose - protein A ở chỗ tất cả các phân lớp kháng thể có nguồn gốc từ chuột có thể thu được.
Tính ổn định của tế bào lai và kháng thể đơn dòng: Một trong những vấn đề cần được nghiên cứu trong quá trình sản xuất kháng thể đơn dịng là tính khơng ổn định của tế bào lai. Trong quá trình liên hợp tế bào lai, tế bào lai được hình thành ngẫu nhiên giữa các tế bào ở các giai đoạn phân bào khác nhau. Có thể tế bào ở giai đoạn phân kỳ là giai đoạn duy nhất thích hợp cho sự liên hợp các tế bào và cho tế bào lai với đặc tính ổn định. Sự tập trung quá sớm các nhiễm sắc thể thường xảy ra trong q trình liên hợp và sau đó là một trong các q trình gây nên sự mất nhiễm sắc thể trong các tế bào lai. Điều này thường thấy ở các tế bào lai có nguồn gốc từ người. Mất nhiễm sắc thể ở các tế bào lai ở chuột thường ít xảy ra.
Sự thay đổi các điều kiện vật lý như trong q trình tinh chế, bảo quản cũng có thể thay đổi hoạt tính của kháng thể đơn dịng. Ngồi ra sự nhiễm các vi sinh vật khác cũng có thể gây thối hóa các kháng thể đơn dịng do hoạt tính của các men proteasa của vi sinh vật nhiễm (Nguyễn Đỗ Quyên, 2004).
Nguyên lý của quá trình chọn lọc: Trong mơi trường chứa Aminopterin (A) thì A sẽ ức chế quá trình tổng hợp các bazơ nitơ cần thiết cho sự sao chép của
phân tử ADN từ các dẫn xuất ban đầu (con đường tổng hợp ADN de novo). Vì vậy tế bào sẽ khơng thể sống được trong loại môi trường này. Nếu ta bổ sung thêm Hypoxanthin (H) và Thymidin (T) thì tế bào vẫn sống được do chuyển hóa H và T thành các bazơ nitơ. Hypoxanthin phosphoribosyltransferase (HPRT) sẽ chuyển hóa hypoxanthin thành guanin. Tuy nhiên, các thể đột biến HPRT- khơng có khả năng này vì vậy chúng bị chết trong mơi trường HAT. Trong môi trường