Phần 3 Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột
Gây miễn dịch cho chuột bằng phương pháp tiêm vào gan bàn chân chuột. Kháng nguyên được dùng để gây miễn dịch cho chuột là Progesterone 3 - CMO.
Chuẩn bị sẵn 8 chuột cái BAL b/c thuần chủng, khỏe mạnh, không mang thai, độ tuổi 6 tuần tuổi, được nuôi dưỡng ở điều kiện đảm bảo nhằm phát huy tốt khả năng tạo kháng thể cho chuột được chia làm 4 lơ thí nghiệm và gây miễn dịch như sau: Sử dụng Kháng nguyên Progesterone 3 - CMO với nồng độ:
50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml, 300µg/ml tiêm cho chuột. Đánh giá nồng độ nào thích hợp nhất để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Dùng kháng nguyên đã pha loãng để tạo nhũ tương với chất bổ trợ Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) theo tỷ lệ 1:1. Trộn đều để đồng nhất hỗn dịch trong các xi lanh.
Ngày thứ 1 tiêm 50µl nhũ tương FCA dưới da hai bàn chân chuột (gây miễn dịch lần 1). Ngày thứ 4 sau khi gây miễn dịch lần 1, tiêm 50µl nhũ tương FIA vào dưới da hai bàn chân chuột. Ngày thứ 7 sau khi gây miễn dịch, tiêm nhắc lại nhũ tương FIA.
Trước khi tiêm cần sát trùng vùng bàn chân chuột bằng bông cồn70o. Khi tiêm các dịch nhũ tương, cần chú ý tránh các mạch máu lớn của chuột. Cung cấp đủ thức ăn, nước uống cho chuột và theo dõi chuột mỗi ngày ít nhất 2 lần. Nếu vết tiêm có dấu hiệu hoại tử cần loại bỏ chuột và gây miễn dịch thay thế cho con khác.
Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột đến ngày thứ 10, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột trong mỗi lơ thí nghiệm, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể, tức khả năng sinh kháng thể kháng progesterone. Phản ứng ELISA được sử dụng để phát hiện sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh. Mỗi mẫu huyết thanh của chuột được thử nghiệm trong 11 giếng (n=11) trên khay ELISA có 96 giếng.
Hình 3.1. Gây miễn dịch cho chuột
Ở các cá thể chuột đã được gây miễn dịch sẽ sinh kháng thể đa dòng kháng progesterone, kháng thể này được kiểm tra bằng phương pháp ELISA. Để tiến hành phản ứng ELISA cần có kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất tạo màu dưới tác dụng của enzyme. Nếu lượng enzyme được giữ lại càng nhiều thì màu thể hiện càng rõ, giá trị OD càng lớn (cũng có nghĩa lượng kháng thể cần xác
định càng ít). Nếu trong mẫu khơng có kháng thể cần xác định thì khơng có
enzyme nên phản ứng màu khơng xảy ra.
Thí nghiệm được thực hiện sử dụng cơ chất là TMB, enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, dừng phản ứng bằng H2SO4 thì màu vàng xuất hiện.
Bước sóng hấp phụ của màu tương ứng 630 ŋm khi đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học (OD). Đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học (OD) tương ứng với các bước sóng màu thể hiện.