Tế bào Myeloma lúc đầu mới phục hồi độ phủ bám trên đĩa chưa nhiều, sau 72h tế bào sinh sản và phát triển nhanh, độ phủ bám trên đĩa đã gần như kín hết mặt đĩa.
Sau khi tiến hành dung hợp hai loại tế bào trên, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc HAT và HT, chúng tơi tiến hành kiểm tra tồn bộ số giếng dưới kính
hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai. Hình 4.2 là hình ảnh tế bào lai hybridoma thu được ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau.
Tế bào lai 5 ngày tuổi Tế bào lai 7 ngày tuổi
Tế bào lai 10 ngày tuổi Tế bào lai 13 ngày tuổi (sau khi thay môi trường HAT bằng mơi trường HT) Hình 4.2. Tế bào lai hybridoma thu được ở các
thời điểm nuôi cấy khác nhau
Tế bào lai được nuôi dưỡng bằng môi trường HAT, lúc 5 ngày tuổi tập trung thành đám nhỏ, sau 10 ngày tuổi đã sinh sơi, phát triển nhanh chiếm diện tích 70 - 80% bề mặt đĩa. Đến khi tế bào lai 13 ngày tuổi thay môi trường nuôi dưỡng HAT bằng mơi trường HT soi dưới kính hiển vi thì các tế bào lai này được phân bố khắp mặt đĩa nuôi cấy, sinh sản và phát triển rất nhanh.
Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành 3 đợt thí nghiệm khác nhau để sản xuất tế bào lai hybridoma tiết kháng thể đơn dịng. Mỗi đợt thí nghiệm, sau
khi lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào trên 8 đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng và kết quả được trình bày trong bảng 4.3 kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào Lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Bảng 4.3. Kết quả lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên
progesterone 3 - CMO Lần lai (fusion) Số lượng tế bào dùng để lai Số đĩa nuôi cấy tế bào dùng (đĩa 96 giếng) Tổng số giếng nuôi cấy tế bào Tổng số giếng có tế bào lai Tỷ lệ % số giếng có tế bào lai/giếng ni cấy tế bào Tế bào Myeoloma Tế bào lympho B 1 2 x 107 2 x 108 8 768 740 96,35 2 2 x 107 2 x 108 8 768 696 90,63 3 2 x 107 2 x 108 8 768 728 94,79
Sử dụng tế bào Myeloma với số lượng 2 x 107 lai với tế bào Lympho B 2 x 108 với tổng số giếng nuôi cấy tế bào là 768 giếng qua 3 lần lai tạo.
Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ lai tạo thành công tế bào lai là rất cao, tỷ lệ các giếng ni cấy có tế bào lai giao động từ 90,63 - 96,35% với số đĩa nuôi cấy tế bào dùng là 8 đĩa trên đĩa 96 giếng.
Cụ thể:
- Lần lai thứ nhất có 740/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 96,35%.
- Lần lai thứ hai có 696/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 90,63% - Lần lai thứ ba có 728/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 94,79%. Ở lần lai thứ nhất cho kết quả cao nhất với 740/768 giếng có tế bào lai, đạt 96,35%.
Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào Lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone 3 - CMO cho thấy tỷ lệ % số giếng có tế bào lai trên số giếng ni cấy tế bào thì lần lai thứ nhất có kết quả cao nhất so với lần lai thứ hai và lần lai thứ ba.
4.3. KẾT QUẢ SÀNG LỌC KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG
Ni cấy tế bào bằng môi trường HT 2 - 4 ngày. Tiến hành kiểm tra khả năng tiết kháng thể đơn dòng của các tế bào lai để sàng lọc các tế bào dương tính. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm.
Để sàng lọc được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng mong muốn, dịch ni cấy tế bào của tất cả các giếng có tế bào lai đã được thu nhận và được dùng cho phản ứng ELISA. Trong nghiên cứu này kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho chuột cũng như dùng để gắn bản ELISA (200µg/giếng) là Progesterone 3 - CMO.
Điều này cũng có nghĩa là sẽ có 3 khả năng xảy ra đối với tế bào lai được sinh ra, bao gồm:
(1)tế bào lai được tạo ra nhưng khơng tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu. (2)tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 – CMO.
(3)tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên gắn bản BSA. Để sàng lọc và thu nhận được đúng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, hai loại kháng nguyên là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA đã được sử dụng một cách riêng rẽ để gắn bản ELISA.
Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng bằng phản ứng ELISA được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên bằng phản ứng ELISA
Lần lai (fusion) Tổng số giếng kiểm tra Kết quả phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên gắn bản là Progesterone 3 - CMO Sử dụng kháng nguyên gắn bản BSA
Số giếng cho kết quả dương tính với Progesterone 3 - CMO mà khơng dương tính với kháng nguyên là BSA Số giếng dương tính Tỉ lệ % Số giếng dương tính Tỉ lệ % Số giếng dương tính Tỉ lệ % 1 740 5 0,64 5 0,64 0 0 2 696 14 2,01 14 2,01 0 0 3 728 22 3,02 20 2,74 2 (2E4, 2E7)* 0,27
*2E4, 2E7 là ký hiệu tên của hai dịng tế bào lai cho kết quả dương tính với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO mà khơng dương tính với kháng ngun BSA.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.4 cho thấy, có 2 dịng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Ở lần lai thứ nhất có 5/740 giếng (0,64%) cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA.
Lần lai thứ 2 có 14/696 giếng (2,01%) cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên gắn bản BSA.
Đối với lần lai thứ 3 thì có 22/728 giếng (3,02%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, trong khi chỉ có 20/728 giếng (2,74%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA, điều này cũng có nghĩa là trong số 22 giếng cho kết quả ELISA dương tính thì 20/22 (90,91%) giếng có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone 3 - CMO và chỉ có 2/22 (9,09%) giếng có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone 3 - CMO mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Như vậy sau 3 lần lai chúng tôi đã lai tạo thành công 2 giếng (2E4, 2E7) hybridoma tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu. Những giếng có hiệu giá kháng thể cao sẽ cho giá trị cao. Từ kết quả này chúng tơi đã chọn 2 giếng có hiệu giá cao nhất để đánh giá tiếp.
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ELISA các giếng dương tính (Sàng lọc lần 1 ở 22 giếng)
STT Tên Giếng Progesterone 3 - CMO BSA
1 1C3 1.163 0.332 2 1D8 1.045 0.320 3 1F12 1.352 0.619 4 2E4 1.09 0.042 5 2E7 1.234 0.058 6 2F8 1.125 0.493 7 2G10 1.273 0.512 8 3A6 1.235 0.482 9 3C9 1.008 0.544 10 3C10 1.128 0.698 11 4B12 1.013 0.480 12 4D6 1.115 0.723 13 5E6 1.122 0.452 14 5F11 1.281 0.842 15 5H11 1.212 0.523 16 6C4 1.104 0.711 17 6D9 1.105 0.802 18 6D11 1.005 0.347 19 7B2 1.03 0.712 20 7G5 1.106 0.623 21 8H1 1.117 0.442 22 8H3 1.028 0.527 23 ĐC (-) 0.053 0.051
Sau khi sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA bằng phương pháp ELISA tương tự như sàng lọc lần 1. Ở lần sàng lọc này chỉ chọn những giếng có tế bào lai và có kết quả tốt ở lần 1. Tuy nhiên khi bố trí thí nghiệm sẽ gắn kháng nguyên song song giữa kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên BSA.
Pha loãng kháng nguyên Progeaterone 3 - CMO tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate và BSA đạt nồng độ 2µg/ml trong PBS 1x. Vortex mạnh để có dung dịch đồng nhất. Dùng pipet đa kênh cho 100 µl kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA đã pha lỗng vào mỗi giếng của đĩa ELISA được trình bày ở bảng 4.6 như sau:
Bảng 4.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để sàng lọc kháng thể đơn dòng
1 2 3 4 5 6
A CMO BSA CMO BSA CMO BSA
B CMO BSA CMO BSA CMO BSA
Giếng A1 (CMO), giếng A2 (BSA), giếng A3 (CMO), giếng A4 (BSA), giếng A5 (CMO), giếng A6 (BSA)…
Giếng B1 (CMO), giếng B2 (BSA), giếng B3 (CMO), giếng B4 (BSA), giếng B5 (CMO), giếng B6 (BSA)…
Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm.
Kết quả sàng lọc kháng thể đơn dịng được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7 cho thấy, các giếng cho kết quả tốt là những giếng cho hiệu giá kháng thể cao với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO nhưng không đặc hiệu với BSA.
- Tên các giếng được đặt theo vị trí các đĩa ni cấy chứa chúng.
- Giếng 2E4 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO (1,104) nhưng không đặc hiệu với BSA (0,052).
- Giếng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO (1,204) nhưng không đặc hiệu với BSA (0,051).
- 20 giếng còn lại đều tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA.
Như vậy có 2 giếng tế bào là giếng 2E4 và giếng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO nhưng không đặc hiệu với BSA. Do trong mỗi giếng có nhiều nhóm tế bào khác nhau, có nhóm tiết kháng thể đơn dịng, nhưng có nhóm khơng tiết nên chúng tơi tiếp tục tiến hành tách dòng tế bào lai để thu được các dòng tế bào tốt nhất.
Bảng 4.7. Kết quả sàng lọc lần 2 (Giá trị OD)
STT Tên Giếng Progesterone 3-CMO BSA
1 1C3 1.109 0.435 2 1D8 1.135 0.389 3 1F12 1.352 0.639 4 2E4 1.104 0.052 5 2E7 1.204 0.051 6 2F8 1.159 0.593 7 2G10 1.093 0.622 8 3A6 1.105 0.432 9 3C9 1.114 0.584 10 3C10 1.138 0.598 11 4B12 1.009 0.439 12 4D6 1.102 0.923 13 5E6 1.139 0.482 14 5F11 1.109 0.942 15 5H11 1.125 0.523 16 6C4 1.024 0.621 17 6D9 1.098 0.302 18 6D11 1.108 0.547 19 7B2 1.132 0.612 20 7G5 1.159 0.823 21 8H1 1.017 0.482 22 8H3 1.134 0.526 23 ĐC (-) 0.053 0.051
4.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG SAU KHI TÁCH DÒNG KHI TÁCH DÒNG
Khi đã xác định được giếng chứa tế bào tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu, chúng tơi tiến hành tách dòng các tế bào này. Trong cùng một giếng tế bào, có thể có các nhóm tế bào tiết kháng thể đơn dòng sinh trưởng đồng thời với các nhóm tế bào khơng tiết kháng thể đơn dòng. Do vậy, việc tách dòng các tế bào này sẽ giúp hiệu giá kháng thể cao hơn.
Sau 3 - 4 ngày tách dịng, có thể quan sát rõ các nhóm tế bào trong giếng ni cấy. Chọn lọc các giếng chỉ có một nhóm tế bào duy nhất để đánh giá hiệu giá bằng phương pháp ELISA (sử dụng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA).
Chọn lọc dòng tế bào sinh kháng thể có tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Để khẳng định tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng kháng progesterone của 5 dòng tế bào thu được ở trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp ELISA.
Bảng 4.8. Kết quả 5 dòng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO
Tên Dòng Progesterone 3 - CMO BSA
2E4C5 1.109 0.054 2E4F6 1.135 0.049 2E4G8 1.352 0.056 2E7D2 1.104 0.052 2E7H6 1.204 0.051 ĐC (-) 0.050 0.052
Bảng 4.8 cho thấy, 5 dòng tế bào lai (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO. Từ 5 dịng tế bào này, chúng tơi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản.
Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dịng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của kháng thể đơn dịng với kháng ngun và các chất khác có cấu trúc phân tử tương tự như progesterone và có trong huyết thanh là hormone steroid như progesterone, estradiol, pregnenolon. Ngoài progesterone trong máu động vật cịn có hormone steroid trên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone. Chúng tơi dùng kháng thể đơn dịng mới thu được lần lượt thử nghiệm với đại diện các nhóm kháng nguyên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone nói trên và thu được kết quả qua bảng 4.9 như sau:
Bảng 4.9. Tính đặc hiệu của kháng thể đơn dịng do 5 dòng tế bào tạo ra STT Dòng
tế bào
Kháng nguyên
Progesterone Estradiol Pregnenolon
1 2E4C5 + - - 2 2E4F6 + + - 3 2E4G8 + - + 4 2E7D2 + - + 5 2E7H6 + + - (+) dương tính; (-) âm tính
Kết quả bảng 4.9 cho thấy:
- Các dòng tế bào 2E4G8 và 2E7D2 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, pregnenolon.
- Dòng tế bào 2E4F6, 2E7H6 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, estradiol.
- Dòng tế bào 2E4C5 cho kết quả dương tính với progesterone và âm tính với Estradiol, pregnenolon. Kháng thể do dịng tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu cao, chúng phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone và chỉ kháng đặc hiệu với progesterone.
- Kháng thể do 4 dòng (2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu khơng cao, khơng phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone với các dạng hormone gần giống với chúng.
- Kháng thể đơn dòng là kháng thể chỉ có khả năng kết hợp đặc hiệu với một loại kháng nguyên duy nhất mà không kết hợp với các loại kháng nguyên khác cho dù chúng có cấu tạo hóa học gần giống với kháng nguyên đó.
Một dịng tế bào có chất lượng cao ngồi khả năng sinh kháng thể có tính đặc hiệu cao cần phải có sức sống tốt, khả năng sinh kháng thể nhiều, từ đó mới đảm bảo tạo được một lượng lớn kháng thể trên quy mô công nghiệp, đủ để phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế.
Dựa vào kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và khả năng phát triển của 5 dòng tế bào, chúng tơi chỉ chọn dịng 2E4C5 có tính đặc hiệu cao, tiếp tục nhân ni và thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Ni tơ lỏng và gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao.
4.5. NHÂN GIỐNG TẾ BÀO
Từ giếng chứa dòng tế bào tách dịng, chúng tơi tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột. Để bảo quản được tế bào trong thời gian dài, chúng tôi tiến hành cất giống tế bào và bảo quản trong Ni tơ lỏng. Khi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào đã bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai ni cấy thì tiến hành cất giống tế bào.
Tế bào lai khi mới chuyển ra đĩa, chai nuôi mới
Tế bào lai sau 36h nuôi cấy
Tế bào lai sau 72h nuôi cấy
Hình 4.3. Tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau Nhân giống tế bào đã được trình bày ở phần phương pháp. Từ đĩa 24 giếng Nhân giống tế bào đã được trình bày ở phần phương pháp. Từ đĩa 24 giếng có 1ml mơi trường DMEM 10% hỗn dịch tế bào được ni trong tủ ấm có bổ sung CO2. Sau 3 đến 5 ngày lượng tế bào ở các giếng của đĩa 24 giếng được nhân lên về số lượng và đạt 90 đến 100% bề mặt đĩa.
Tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa 6 giếng có sẵn 3ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được ni cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 4 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T25 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được ni cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 3 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T75 có sẵn 4ml mơi trường