KHI TÁCH DÒNG
Khi đã xác định được giếng chứa tế bào tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu, chúng tôi tiến hành tách dòng các tế bào này. Trong cùng một giếng tế bào, có thể có các nhóm tế bào tiết kháng thể đơn dòng sinh trưởng đồng thời với các nhóm tế bào không tiết kháng thể đơn dòng. Do vậy, việc tách dòng các tế bào này sẽ giúp hiệu giá kháng thể cao hơn.
Sau 3 - 4 ngày tách dòng, có thể quan sát rõ các nhóm tế bào trong giếng nuôi cấy. Chọn lọc các giếng chỉ có một nhóm tế bào duy nhất để đánh giá hiệu giá bằng phương pháp ELISA (sử dụng kháng nguyên Progesterone 3 -
Chọn lọc dòng tế bào sinh kháng thể có tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Để khẳng định tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng kháng progesterone của 5 dòng tế bào thu được ở trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp ELISA.
Bảng 4.8. Kết quả 5 dòng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO
Tên Dòng Progesterone 3 - CMO BSA
2E4C5 1.109 0.054 2E4F6 1.135 0.049 2E4G8 1.352 0.056 2E7D2 1.104 0.052 2E7H6 1.204 0.051 ĐC (-) 0.050 0.052
Bảng 4.8 cho thấy, 5 dòng tế bào lai (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO. Từ 5 dòng tế bào này, chúng tôi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản.
Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của kháng thể đơn dòng với kháng nguyên và các chất khác có cấu trúc phân tử tương tự như progesterone và có trong huyết thanh là hormone steroid như progesterone, estradiol, pregnenolon. Ngoài progesterone trong máu động vật còn có hormone steroid trên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone. Chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng mới thu được lần lượt thử nghiệm với đại diện các nhóm kháng nguyên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone nói trên và thu được kết quả qua bảng 4.9 như sau:
Bảng 4.9. Tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra STT Dòng
tế bào
Kháng nguyên
Progesterone Estradiol Pregnenolon
1 2E4C5 + - - 2 2E4F6 + + - 3 2E4G8 + - + 4 2E7D2 + - + 5 2E7H6 + + - (+) dương tính; (-) âm tính
Kết quả bảng 4.9 cho thấy:
- Các dòng tế bào 2E4G8 và 2E7D2 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, pregnenolon.
- Dòng tế bào 2E4F6, 2E7H6 đều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên progesterone, estradiol.
- Dòng tế bào 2E4C5 cho kết quả dương tính với progesterone và âm tính với Estradiol, pregnenolon. Kháng thể do dòng tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu cao, chúng phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone và chỉ kháng đặc hiệu với progesterone.
- Kháng thể do 4 dòng (2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) tế bào này sinh ra có tính đặc hiệu không cao, không phân biệt được các loại hormone gần giống với progesterone với các dạng hormone gần giống với chúng.
- Kháng thể đơn dòng là kháng thể chỉ có khả năng kết hợp đặc hiệu với một loại kháng nguyên duy nhất mà không kết hợp với các loại kháng nguyên khác cho dù chúng có cấu tạo hóa học gần giống với kháng nguyên đó.
Một dòng tế bào có chất lượng cao ngoài khả năng sinh kháng thể có tính đặc hiệu cao cần phải có sức sống tốt, khả năng sinh kháng thể nhiều, từ đó mới đảm bảo tạo được một lượng lớn kháng thể trên quy mô công nghiệp, đủ để phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế.
Dựa vào kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và khả năng phát triển của 5 dòng tế bào, chúng tôi chỉ chọn dòng 2E4C5 có tính đặc hiệu cao, tiếp tục nhân nuôi và thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Ni tơ lỏng và gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao.
4.5. NHÂN GIỐNG TẾ BÀO
Từ giếng chứa dòng tế bào tách dòng, chúng tôi tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột. Để bảo quản được tế bào trong thời gian dài, chúng tôi tiến hành cất giống tế bào và bảo quản trong Ni tơ lỏng. Khi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào đã bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai nuôi cấy thì tiến hành cất giống tế bào.
Tế bào lai khi mới chuyển ra đĩa, chai nuôi mới
Tế bào lai sau 36h nuôi cấy
Tế bào lai sau 72h nuôi cấy
Hình 4.3. Tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau Nhân giống tế bào đã được trình bày ở phần phương pháp. Từ đĩa 24 giếng có 1ml môi trường DMEM 10% hỗn dịch tế bào được nuôi trong tủ ấm có bổ sung CO2. Sau 3 đến 5 ngày lượng tế bào ở các giếng của đĩa 24 giếng được nhân lên về số lượng và đạt 90 đến 100% bề mặt đĩa.
Tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa 6 giếng có sẵn 3ml môi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 4 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T25 có sẵn 4ml môi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Sau 2 đến 3 ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T75 có sẵn 4ml môi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm có bổ sung CO2.
Hình 4.3 tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau ta thấy: Lúc tế bào lai mới được chuyển qua đĩa, chai nuôi cấy mới thì tế bào lai nằm rải rác chiếm diện tích 5% bề mặt đáy chai nuôi cấy, sau 36h nuôi cấy, tế bào lai được nuôi dưỡng, sinh sản, phát triển nhanh chóng chiếm diện tích 40 - 50 % bề mặt đáy chai nuôi cấy, sau 72h nuôi cấy tế bào lai đã bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai nuôi cấy, lúc này có thể sử dụng cho thí nghiệm tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột.
4.6. GÂY BÁNG CHO CHUỘT
Kháng thể đơn dòng có thể thu nhận từ dịch nổi của chai nuôi tế bào lai. Theo Karsten và Rudloph, 1985 thì ta có thể thu nhận được kháng thể cao hơn từ 100 đến 1000 lần nếu tiêm các tế bào lai vào xoang bụng của chuột, tiêm pristane. Sau khoảng 7 - 12 ngày thì thu dịch báng.
Trong thí nghiệm này, thực hiện tiêm tế bào lai 2E4C5 vào xoang bụng của chuột đã được trình bày ở phần phương pháp, sau 10 ngày bụng chuột có báng to lên thì ta thu dịch báng. Đã gây báng thành công được 3 chuột (chuột AA1, chuột AA6, chuột AA8 trên tổng số 10 chuột). Kết quả thu được sau mỗi lần lấy dịch báng ở chuột là 6ml/con/lần, từ 3 - 5 lần/con.
PHẦN 5. KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Sử dụng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO gây miễn dịch cho chuột.
Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO sẽ cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt nhất. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể không những phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch mà còn phụ thuộc vào cá thể động vật.
- Tạo được 2 dòng tế bào là dòng 2E4 và dòng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO nhưng không đặc hiệu với BSA.
- Sau khi dung hợp và tách dòng đã lai tạo thành công 5 dòng tế bào
(2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có khả năng sinh kháng thể đơn dòng kháng progesterone.
- Trong 5 dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng đã chọn lọc dòng tế bào
2E4C5 có khả năng sinh sản tốt, kháng thể có tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể cao sẽ được nhân nuôi và gây báng cho chuột và bảo quản trong nitơ lỏng.
- Đã gây báng thành công được 3 chuột (chuột AA1, chuột AA6, chuột AA8 trên tổng số 10 chuột) lượng báng thu được trung bình 6ml/con/lần.
5.2. KIẾN NGHỊ
Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng gồm nhiều giai đoạn khác nhau, trong đó việc sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc, kiểm tra, đánh giá kháng thể đơn dòng là cần thiết và thực sự đem lại hiệu quả. Tuy nhiên để hoàn thành các bước của quy trình và có được kháng thể đơn dòng chất lượng cao đáp ứng được việc tạo Kit định lượng progesterone thì cần phải nghiên cứu sâu hơn.
Đề tài mới chỉ có được những kết quả bước đầu là tạo ra những dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone năng suất cao, chất lượng tốt. Với kết quả này chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu với cấu trúc kháng nguyên khác và tối ưu hóa qui trình tạo kháng thể đơn dòng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt:
1. Chung Anh Dũng và cs. (2001). Ứng dụng kỹ thuật RIA để định lượng progesterone trong huyết thanh bò.
2. Đỗ Phương Liên (1999). Miễn dịch học cơ sở. NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.
3. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng và Lê Trần Bình (2008). Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2). tr. 203-208.
4. Đỗ Kim Tuyên (1995). Nghiên cứu gây siêu bài noãn ở bò bằng sử dụng FSH và Prostaglandin F2α. Luận án phó Tiến sĩ khoa học Nông nghiệp.
5. Lê Văn Thọ và Lê Xuân Cương (1979). Kích dục tố ứng dụng trong chăn nuôi. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Bá Mùi và Đinh Văn Bình (2006). Khả năng sinh sản của một số giống dê nhập nội. Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp. Trường đại học nông nghiệp I, Hà Nội. tr.126-130.
7. Nguyễn Đỗ Quyên (2004). Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng. Luận án Tiến sĩ khoa học y dược.
8. Nguyễn Như Thanh (1997). Miễn dịch học Thú y. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. tr. 7-10, 40-45.
9. Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi và Lê Mộng Loan (1996). Sinh lý học gia súc. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Nguyễn Đăng Tường và cs. (1982).Sinh lý học.tập II,NXB Học viện Quân Y. 11. Phan Văn Kiểm và Nguyễn Bá Mùi (2005). Định lượng progesteron trong máu,
góp phần đánh giá tình trạng sinh sản của đàn bò sữa. Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp. Trường đại học nông nghiệp I, Hà Nội. tr. 130-134.
12. Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa và Tăng Xuân Lưu (2003). Ứng dụng kết quả nghiên cứu hàm lượng progesteron để chẩn đoán và điều trị rối loạn sinh sản ở bò sữa. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. tr.708-711.
13. Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long và Nguyễn Văn Thanh (2002). Sinh sản gia súc. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
14. Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh (2006). Sinh lý học người và động vật, tập II. NXB Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
Tài liệu Tiếng nước ngoài:
15. Baruselli P.S., E.L.Reis, M.O.Marques, L.F.Nasser and G.A. Bób (2004). The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science. pp.479-486.
16. John H. Kirk et al., (1999). Review of Reproductive Hormones For Dairy Cows, Veterinary Medicine Extension, University of California, Davis.
17. Köhler G. and C. Milstein (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256 (5517). pp.495.
18. Maurice J. Sauner, John A. Foulkes and Alan D. Cookson (1981). Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk. Steroids, volume 38, number 1. UK. pp.45-52.
19. Nakao .T, A. Sugihashi, N. Saga, N. Tsunda and K. Kawata (1983). An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk. Br. veterinary japan. pp.109-117.
20. Sauerwein H., B.H.Breier, B.W. Gallaher et al., (2000). Growth hormone treatment of breeding bulls used for artificial insemination improves fertilization rates. Domestic Animal Endocrinology, v.18. pp.145-158.
21. Schwaber J. and E.P. Cohen (1973). Human x mouse somatic cell hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental types. Nature 244 (5416). pp.444-447. 22. Van De Weil .D.F.M and W. Koops (1986). Development and validation of an
Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma. Annimal Reproduction Sience. pp.201-203.
23. Wu L.S, I.C Guo and J.H. Lin (1997). Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test. Asia- Australasian journal of Animal Science. pp.603-608.