Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay).
Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ŋg/ml). So với kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
3.1.1. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng dòng BAL b/c thuần chủng 4 - 6 tuần tuổi Số lượng là 30 con.
3.1.2. Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma)
Dòng tế bào Myeloma Sp2/0 (tế bào ung thư tủy của chuột cùng dòng BAL b/c) do Sigma cung cấp.
3.1.3. Các thiết bị thí nghiệm
- Tủ nuôi tế bào có điều hòa nhiệt độ và CO2 tự động.
- Tủ cấy vô trùng sử dụng đèn cực tím và màng lọc 0,25µm (Microflow, Anh). - Chai lọ nuôi cấy, pipet, xilanh các loại.
- Khay đựng mẫu. - Đĩa nuôi cấy. - Kính hiển vi. - Buồng đếm tế bào. - Máy đọc ELISA. - Ly tâm lạnh.
3.1.4. Các hóa chất thí nghiệm Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy:
- DMEM (DulbecoModifieMedium);
- HAT (HypoxanthineAminopterinThimidine); - PBS (Photphate Buffesed Saline);
- RPMI;
- Kháng nguyên 4-pregnene-3 20-dione 3-O-Carboxymethyloxime. Reference Code (Q2606-000) do hãng Steraloids - Mỹ cung cấp.
Hóa chất thí nghiệm:
- PEG (Polyethylene glycol-PEG 1500), FCA (Freundcomplex Adjuvant); - HRPG Antimouse;
- HCL, Bicarbonate;
- Bovine Serum Albumin (BSA);
- Kháng sinh Gentamycin, Penicillin. 3.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian tiến hành từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm của Công ty Cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD) Hưng Yên.
3.2. NỘI DUNG
3.2.1. Gây miễn dịch cho chuột
Kháng nguyên là hormone progesterone của hãng Steroloid. Gây miễn dịch cho chuột cái BAL b/c với kháng nguyên trên.
Thu kháng huyết thanh đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên.
Thu tế bào lympho B ở lách của chuột đã mẫn cảm kháng nguyên. 3.2.2. Dung hợp tế bào Myeloma và tế bào lympho B
Nuôi cấy tế bào Myeloma Sp 2/0 dùng để dung hợp với tế bào lympho B. Sử dụng phương pháp ELISA để chọn tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu cao.
3.2.3. Sàng lọc các dòng tế bào dương tính với kháng nguyên bằng phương pháp ELISA pháp ELISA
3.2.4. Nhân giống các dòng tế bào đã chọn lọc
Nhân dòng tế bào lai có khả năng sinh kháng với số lượng lớn cất giữ và gây báng cho chuột.
3.2.5. Gây báng cho chuột
Tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột để thu nước dịch báng có nồng độ kháng thể cao. Sau 7 - 10 ngày tiến hành thu dịch báng trong xoang bụng chuột và xác định nồng độ kháng thể.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột
Gây miễn dịch cho chuột bằng phương pháp tiêm vào gan bàn chân chuột. Kháng nguyên được dùng để gây miễn dịch cho chuột là Progesterone 3 - CMO.
Chuẩn bị sẵn 8 chuột cái BAL b/c thuần chủng, khỏe mạnh, không mang thai, độ tuổi 6 tuần tuổi, được nuôi dưỡng ở điều kiện đảm bảo nhằm phát huy tốt khả năng tạo kháng thể cho chuột được chia làm 4 lô thí nghiệm và gây miễn dịch như sau: Sử dụng Kháng nguyên Progesterone 3 - CMO với nồng độ: 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml, 300µg/ml tiêm cho chuột. Đánh giá nồng độ nào thích hợp nhất để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Dùng kháng nguyên đã pha loãng để tạo nhũ tương với chất bổ trợ Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) theo tỷ lệ 1:1. Trộn đều để đồng nhất hỗn dịch trong các xi lanh.
Ngày thứ 1 tiêm 50µl nhũ tương FCA dưới da hai bàn chân chuột (gây miễn dịch lần 1). Ngày thứ 4 sau khi gây miễn dịch lần 1, tiêm 50µl nhũ tương FIA vào dưới da hai bàn chân chuột. Ngày thứ 7 sau khi gây miễn dịch, tiêm nhắc lại nhũ tương FIA.
Trước khi tiêm cần sát trùng vùng bàn chân chuột bằng bông cồn70o. Khi tiêm các dịch nhũ tương, cần chú ý tránh các mạch máu lớn của chuột. Cung cấp đủ thức ăn, nước uống cho chuột và theo dõi chuột mỗi ngày ít nhất 2 lần. Nếu vết tiêm có dấu hiệu hoại tử cần loại bỏ chuột và gây miễn dịch thay thế cho con khác.
Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột đến ngày thứ 10, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột trong mỗi lô thí nghiệm, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể, tức khả năng sinh kháng thể kháng progesterone. Phản ứng ELISA được sử dụng để phát hiện sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh. Mỗi mẫu huyết thanh của chuột được thử nghiệm trong 11 giếng (n=11) trên khay ELISA có 96 giếng.
Hình 3.1. Gây miễn dịch cho chuột
Ở các cá thể chuột đã được gây miễn dịch sẽ sinh kháng thể đa dòng kháng progesterone, kháng thể này được kiểm tra bằng phương pháp ELISA. Để tiến hành phản ứng ELISA cần có kháng nguyên Progesterone 3 - CMO, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất tạo màu dưới tác dụng của enzyme. Nếu lượng enzyme được giữ lại càng nhiều thì màu thể hiện càng rõ, giá trị OD càng lớn (cũng có nghĩa lượng kháng thể cần xác
định càng ít). Nếu trong mẫu không có kháng thể cần xác định thì không có enzyme nên phản ứng màu không xảy ra.
Thí nghiệm được thực hiện sử dụng cơ chất là TMB, enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, dừng phản ứng bằng H2SO4 thì màu vàng xuất hiện.
Bước sóng hấp phụ của màu tương ứng 630 ŋm khi đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học (OD). Đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học (OD) tương ứng với các bước sóng màu thể hiện.
3.3.2. Phương pháp lấy tế bào LymphoB của chuột
Theo phương pháp của OliverJ Leger and Jose.Wsaldanha, 2000.
Giết chuột đã được gây miễn dịch bằng P3-BSA, khử trùng chuột bằng cồn 700. Tách lấy thùy lách và các hạch vào đĩa petri có sẵn 10ml dung dich PBS. Dùng kéo cắt lách và các hạch thành từng mảnh nhỏ, gạt nhẹ để các tế bào rời ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống li tâm, dùng pipetpaster hút lên đẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. Để dung dịch lắng cặn, hút lấy dung dịch tế bào sang một ống li tâm khác. Li tâm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó loại bỏ hết dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10 ml PBS. Lặp lai thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào với DMEM có bổ sung 10% PBS sao cho có mật độ 108 tế bào/ml.
3.3.3. Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp2/0
* Phục hồi tế bào và nhân nuôi tế bào Myeloma
- Chuyển ống tế bào Myeloma từ trong ni tơ lỏng vào trong cốc nước ấm 370C. Khi dung dịch trong ống đã tan đá hoàn toàn, lau khử trùng bên ngoài bằng cồn 700.
- Chuyển huyền dịch tế bào sang ống falcon 15ml có chứa sẵn 10ml môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS, xoáy chặt nắp ống, ly tâm ở tốc độ 1000 vòng trong 5 phút.
- Loại bỏ dung dịch nổi chứa chất bảo quản phía trên, thu cặn tế bào.
- Hòa cặn tế bào trong 20ml môi trường DMEM 10% FBS, dùng pipet đảo đều và chuyển toàn bộ huyền dịch tế bào vào trong chai nuôi cấy T75.
- Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược xem tỉ lệ sống của tế bào. Sau đó nuôi cấy tế bào trong tủ nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
* Bảo quản tế bào
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không nhiễm tạp khuẩn. Hút bỏ môi trường cũ thay vào đó là môi trường mới, dùng pipet hút lên đẩy xuống cho tế bào rời đều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạt bỏ dung dịch nổi, hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được -250C thì đưa nhanh ống cất vào lạnh -700C, sau 20 giờ chuyển vào bình Ni tơ lỏng.
3.3.4. Phương pháp tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
Ba ngày sau lần gây miễn dịch cuối cùng với FIA, chuột được gây mê bằng Chloroform, sát trùng chuột bằng cồn 700, tiến hành thu hạch lách và hạch bẹn của chuột.
Quy trình tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng được thực hiện theo phương pháp của Köhler và Milstein (Köhler and Milstein, 1975). Tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào lympho B được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:10, sau đó ly tâm tế bào ở tốc độc 1000 vòng/phút trong 5 phút và thu cặn tế bào. Nhỏ 0,3 ml dung dịch PEG 50% (M.W. 1450; Sigma) vào cặn tế bào và ủ 60 giây ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung tiếp 10 ml môi trường tế bào DMEM (Invitrogen) vào, ly tâm tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút và thu cặn tế bào. Sau khi loại bỏ dịch nổi và hoàn nguyên cặn tế bào trong môi trường chọn lọc DMEM có bổ sung HAT (Hypoxanthine Aminopterin
Thymidine), 150 µl dung dịch tế bào sẽ được đưa vào mỗi giếng trên đĩa 96
giếng và ủ trong tủ ấm 37oC. Sau 10 ngày, loại bỏ dịch nuôi cấy tế bào và thêm vào mỗi giếng 150 µl môi trường chọn lọc DMEM có bổ sung HT
(Hypoxanthine Thymidine). Sau 2 - 4 ngày, tiến hành kiểm tra khả năng tiết
kháng thể đơn dòng của các dòng tế bào lai bằng phản ứng ELISA để sàng lọc các tế bào dương tính.
Nghiền nhỏ hạch bẹn, hạch lách chuột
Chia tế bào đã dung hợp ra đĩa nuôi tế bào 96 giếng
Hình 3.2. Dung hợp tế bào ra đĩa nuôi cấy 3.3.5. Phương pháp sàng lọc tế bào và tách dòng
* Sàng lọc tế bào tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA
Pha loãng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate. Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất. Dùng pipet 8 kênh cho 100µl kháng nguyên đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA.
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa nuôi cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dòng ra, nếu không có đủ môi trường nuôi, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút. Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl H2SO4 để làm dừng phản ứng.
Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm. Những giếng có hiệu giá kháng thể cao sẽ cho giá trị cao. Từ kết quả này sẽ chọn ra một số giếng có hiệu giá cao nhất để đánh giá tiếp.
* Sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA
Sau khi sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA bằng phương pháp ELISA. Ở lần sàng lọc này chỉ chọn những giếng có tế bào lai và có kết quả tốt nhất ở lần 1. Tuy nhiên, khi bố trí thí nghiệm sẽ gắn kháng nguyên song song giữa kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và kháng nguyên BSA.
Pha loãng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate và chuẩn bị BSA để đạt nồng độ 2µg/ml trong PBS1x. Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất. Dùng pipet đa kênh cho 100µl kháng nguyên Progesterone 3 - CMO và BSA đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA.
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa nuôi cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dòng ra, nếu không có đủ môi trường nuôi, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0,5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho
vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút.
Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl H2SO4 để làm dừng phản ứng. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 ŋm. Những giếng có kết quả