Phần 3 Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.6. Nhân giống tế bào
Từ giếng chứa dòng tế bào tách dòng, tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột.
Chuẩn bị đĩa 24 giếng có sẵn 1ml mơi trường DMEM 10% trong mỗi giếng. Dùng pipet trộn đều để làm bong các tế bào khỏi đáy giếng. Chuyển toàn bộ dịch tế bào sang các giếng trong đĩa 24 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC có bổ sung CO2. Sau 3 - 5 ngày, lượng tế bào trong các giếng của đĩa 24 giếng đạt 90 - 100% bề mặt, tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa 6 giếng.
Quy trình cũng tương tự như trên: Chuẩn bị đĩa 6 giếng có sẵn 3ml mơi trường DMEM 10% FBS. Dùng pipet trộn đều để làm bong tế bào và chuyển dịch sang các giếng trong đĩa 6 giếng. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC có bổ sung CO2.
Sau 2 - 4 ngày, cấy chuyển tiếp các tế bào sang chai T25: Chuẩn bị chai ni cấy tế bào T25 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS. Dùng pipet trộn đều để làm bong tế bào và chuyển dịch sang các chai T25. Ni tế bào trong tủ ấm 370C có bổ sung CO2. Sau 2 - 3 ngày, cấy chuyển tiếp các tế bào sang chai T75.
Để bảo quản được tế bào trong thời gian dài, chúng tôi tiến hành cất giống tế bào và bảo quản trong ni tơ lỏng.
Lắc mạnh chai nuôi cấy để các tế bào bong hết khỏi đáy. Chuyển dịch chứa tế bào sang ống corning 50ml. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dịch sau ly tâm sang ống khác để kiểm tra hiệu giá hoặc loại bỏ. Trộn tế bào trong 5ml môi trường cất giống tế bào, sau đó chuyển 1.5ml vào mỗi ống bảo quản tế bào. Bổ sung 20ml môi trường nuôi cấy vào các chai nuôi tế bào vừa được cất giống. Đặt ống bảo quản trong hộp nhựa để qua đêm ở -70oC (làm lạnh 1-2 oC mỗi phút). Các tế bào đã đóng băng được bảo quản trong bình nitơ lỏng. 3.3.7. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng
- Tiêm cho chuột BALb/c khỏe mạnh, không có chửa, 6 tuần tuổi 0,5ml pristine (2,6,10,14-tetramethyldecanoic acid) hoặc dung dịch FIA (Freund's incomplete adjuvant ) vào xoang bụng chuột.
- Sau 7 ngày, tiến hành tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột.
- Nhân giống các tế bào ra chai T75 trước khi tiêm xoang bụng 3 - 4 ngày. - Lắc mạnh chai nuôi cấy tế bào để các tế bào bong khỏi đáy. Chuyển toàn bộ dịch này sang ống corning 50 ml. Ly tâm 1000 vòng trong 5 phút ở nhiệt độ thường.
- Bổ sung môi trường vào ống và trộn đều.
- Sau 10 ngày, khi quan sát thấy bụng chuột căng phồng thì tiến hành thu dịch báng trong xoang bụng.
- Sau khi thu, cần ly tâm dịch ở 1000 vòng trong 5 phút để loại bỏ cặn tế bào, hồng cầu lẫn trong dịch.
Hình 3.3. Tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột
Hình 3.4. Thu dịch báng xoang bụng chuột
3.3.8. Phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng Nguyên tắc của phương pháp ELISA: Kháng thể đơn dòng đặc hiệu sẽ kết Nguyên tắc của phương pháp ELISA: Kháng thể đơn dòng đặc hiệu sẽ kết hợp với kháng nguyên là protein tái tổ hợp SEB. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể này sẽ được phát hiện thông qua một kháng thể cộng hợp (conjugate) đặc hiệu loài gắn enzyme và một cơ chất hiện màu.
Các bước tiến hành như sau:
- Gắn (coating) đĩa ELISA với 100 µl kháng nguyên Progesterone 3 - CMO qua đêm ở nồng nồng độ thích hợp. Rửa đĩa ELISA đã được gắn kháng nguyên bằng dung dịch rửa (PBS + 0,05% Tween 20) để loại bỏ những kháng nguyên không gắn vào bề mặt bản.
- Che chắn (blocking) đĩa ELISA bằng 300 µl dung dịch rửa có bổ sung 5% sữa loại bơ (Skim milk), ủ đĩa ELISA trong 1 h ở 37oC. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho kháng thể đơn dịng (là dịch ni cấy tế bào lai tiết kháng thể) vào, 100 µl/giếng. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 1 h. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho 100 µl/giếng kháng thể cộng hợp (Horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG, Invitrogen) đặc hiệu loài gắn enzyme vào. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 1h. Rửa đĩa ELISA bằng dung dịch rửa.
- Cho 100 µl/giếng dung dịch cơ chất hiện màu TMB. Ủ đĩa ELISA ở 37oC trong 10 phút, dừng phản ứng bằng H2SO4.
PHẦN 4. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHÁP ELISA
Số lượng chuột BAL b/c là 8 con, chia làm 4 lơ thí nghiệm và gây miễn dịch. Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột theo quy trình gây miễn dịch đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tơi tiến hành lấy máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể tức là khả năng sinh kháng thể kháng progesterone.
Để tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần có kháng nguyên đã biết, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tác dụng của enzyme. Đọc kết quả bằng máy đo mật độ quang học tương ứng với bước sóng của màu thể hiện.
Kết quả phản ứng ELISA được trình bày ở bảng 4.1 là kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm.
Bảng 4.1. Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm Lơ thí nghiệm I II III IV Chuột số 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml) 50 50 100 100 200 200 300 300 Giá trị OD trung bình (n=11) 0,411± 0,021 0,699± 0,012 0,505± 0,024 0,752± 0,025 1,144± 0,022 1,107± 0,031 0,540± 0,027 0,534± 0,036 Đối chứng (-) 0,053
Trong các thí nghiệm thực hiện trên, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB. Enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, dừng phản ứng bằng H2SO4 thì màu vàng xuất hiện. Bước sóng hấp thụ của màu tương ứng là 630 ŋm.
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy:
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 50µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm I, chuột số 1 là 0,411±0,021, chuột số 2 là 0,699±0,012.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 100µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm II, chuột số 3 là 0,505±0,024, chuột số 4 là 0,752±0,025.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 200µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm III, chuột số 5 là 1,144±0,022, chuột số 6 là 1,107±0,031.
- Với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO được pha loãng với nồng độ 300µg/ml thì giá trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra ở lơ thí nghiệm IV, chuột số 7 là 0,540±0,027, chuột số 8 là 0,534±0,036.
Giá trị OD phản ánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của chuột. Giá trị OD càng nhỏ chứng tỏ hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng ít và ngược lại giá trị OD càng lớn thì hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng cao. Với giá trị OD≤0,053 được coi là khơng có kháng thể.
Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm cho thấy:
- Gây miễn dịch cho chuột với hàm lượng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO khác nhau sẽ cho các đáp ứng miễn dịch khác nhau.
- Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt nhất (giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 3 cao hơn giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 1, lô 2, lô 4).
- Cùng lượng kháng nguyên 200µg/ml Progesterone 3 - CMO nhưng chuột số 5 có giá trị OD là 1,144±0,022, chuột số 6 có giá trị OD là 1,107±0,031.
Có thể đưa ra nhận xét là đáp ứng miễn dịch của cơ thể phụ thuộc vào lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể chuột và đáp ứng miễn dịch cũng phụ thuộc vào từng cá thể.
Trên cơ sở kết quả đáp ứng miễn dịch, chuột số 5 và chuột số 6 ở lơ thí nghiệm III có đáp ứng miễn dịch tốt khi dùng kháng nguyên với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO. Vì vậy chúng tơi dùng nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO thích hợp nhất để gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm nhằm thu được những cá thể chuột có đáp ứng miễn dịch tốt nhất.
Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO, chúng tôi tiếp tục tiến hành gây miễn dịch cho 3 chuột cái BAL b/c thuần chủng khác theo quy trình gây miễn dịch đã trình bày ở phần phương pháp. Tiến hành lấy mẫu máu, tách huyết thanh để kiểm tra đáp ứng miễn dịch của từng chuột bằng phản ứng ELISA. Chuột nào có đáp ứng miễn dịch tốt nhất sẽ được chọn để thu lấy tế bào lympho B cho quá trình lai tế bào sau này.
Đây là bước lựa chọn các cá thể chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất, từ đó thu lấy tế bào lympho B phục vụ cho bước lai tế bào sau này. Bước này rất quan trọng vì nếu chúng ta chọn chính xác cá thể có đáp ứng miễn dịch tốt, sinh nhiều kháng thể thì sẽ nâng cao chất lượng tế bào lympho B, từ đó tăng hiệu quả lai tế bào.
Kết quả phản ứng ELISA đo ở bước sóng 630 ŋm bằng máy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể đặc hiệu progesterone được trình bày ở bảng 4.2 là sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu Progesterone trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone 3 - CMO.
Bảng 4.2. Mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone 3 - CMO
STT Mẫu kiểm tra Giá trị OD (n=3)
1 Chuột A 1,042 ± 0,036
2 Chuột B 1,106 ± 0,046
3 Chuột C 1,152 ± 0,03
4 Đối chứng (-) BSA 0,1% 0,051
BSA: BovineSerumAlbumin
Giá trị OD phản ánh nồng độ kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật độ quang học càng nhỏ chứng tỏ lượng kháng thể được giữ lại càng ít và điều này cũng chứng tỏ rằng lượng kháng thể được giữ lại ít, ngược lại mật độ quang học càng lớn chứng tỏ lượng kháng thể được giữ lại càng nhiều và kéo theo hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng nhiều.
Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy:
- Với giá trị OD ≤ 0,051 được coi là khơng có kháng thể.
- Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO được tiêm cho 3 chuột cái, lại cho kết quả khác nhau cho ta thấy khả năng đáp ứng miễn dịch ở các cá thể chuột khác nhau là khác nhau.
- Trong các mẫu huyết thanh thu từ 3 chuột đều cho giá trị OD cao, chứng tỏ 3 chuột thí nghiệm đều có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt. Do đó với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO là phù hợp.
- Mẫu huyết thanh của chuột A có giá trị OD thấp nhất (1,042) và mẫu huyết thanh của chuột C có giá trị OD cao nhất (1,152). Từ kết quả này cho ta thấy hàm lượng kháng thể kháng progesterone trong huyết thanh của chuột A là thấp nhất và hàm lượng kháng thể kháng progesterone trong huyết thanh của chuột C là cao nhất.
Như vậy, đáp ứng miễn dịch không chỉ phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên đưa vào cơ thể mà còn phụ thuộc vào cá thể động vật. Mặc dù tiếp nhận cùng một lượng kháng nguyên như nhau thì mỗi cá thể động vật có đáp ứng miễn dịch khác nhau, nồng độ kháng thể trong huyết thanh cũng khác nhau. Kết quả đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào hai yếu tố chính như sau:
+ Nồng độ kháng nguyên đưa vào cơ thể.
+ Cùng nồng độ kháng nguyên đưa vào thì mỗi cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Dựa vào kết quả đáp ứng miễn dịch, chuột C có đáp ứng miễn dịch tốt nhất nên được lựa chọn để lấy tế bào Lympho B và dung hợp với tế bào Myeloma nhằm thu được tế bào lai sinh kháng thể đơn dịng có chất lượng cao.
4.2. Kết quả lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone.
Để tạo được dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dịng kháng progesterone, chúng tơi tiến hành lai tế bào Myeloma Sp2/0 với tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên.
Tế bào Myeloma Sp2/0 là tế bào ung thư tủy của chuột dịng BAL b/c. Ở điều kiện ni cấy invitro thích hợp, tế bào sản sinh và phát triển rất nhanh, có
địi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ mơi trường. Để có được tế bào Myeloma khỏe mạnh và sẵn sàng trong việc dung hợp tế bào thì mơi trường có bổ sung 10% FBS là thích hợp và mơi trường ni cấy được tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần. Hình 4.1 là hình ảnh tế bào Myeloma được phục hồi ở các thời gian khác nhau.
Tế bào Myeloma khi mới phục hồi Tế bào Myeloma sau 24h phục hồi
Tế bào Myeloma sau 72h phục hồi
Hình 4.1. Tế bào Myeloma được phục hồi ở các thời gian khác nhau Tế bào Myeloma lúc đầu mới phục hồi độ phủ bám trên đĩa chưa nhiều, Tế bào Myeloma lúc đầu mới phục hồi độ phủ bám trên đĩa chưa nhiều, sau 72h tế bào sinh sản và phát triển nhanh, độ phủ bám trên đĩa đã gần như kín hết mặt đĩa.
Sau khi tiến hành dung hợp hai loại tế bào trên, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc HAT và HT, chúng tơi tiến hành kiểm tra tồn bộ số giếng dưới kính
hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai. Hình 4.2 là hình ảnh tế bào lai hybridoma thu được ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau.
Tế bào lai 5 ngày tuổi Tế bào lai 7 ngày tuổi
Tế bào lai 10 ngày tuổi Tế bào lai 13 ngày tuổi (sau khi thay môi trường HAT bằng mơi trường HT) Hình 4.2. Tế bào lai hybridoma thu được ở các
thời điểm nuôi cấy khác nhau
Tế bào lai được nuôi dưỡng bằng môi trường HAT, lúc 5 ngày tuổi tập trung thành đám nhỏ, sau 10 ngày tuổi đã sinh sơi, phát triển nhanh chiếm diện tích 70 - 80% bề mặt đĩa. Đến khi tế bào lai 13 ngày tuổi thay môi trường nuôi dưỡng HAT bằng mơi trường HT soi dưới kính hiển vi thì các tế bào lai này được phân bố khắp mặt đĩa nuôi cấy, sinh sản và phát triển rất nhanh.
Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành 3 đợt thí nghiệm khác nhau để sản xuất tế bào lai hybridoma tiết kháng thể đơn dịng. Mỗi đợt thí nghiệm, sau
khi lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào trên 8 đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng và kết quả được trình bày trong bảng 4.3 kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào Lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Bảng 4.3. Kết quả lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên
progesterone 3 - CMO Lần lai (fusion) Số lượng tế bào dùng để lai Số đĩa nuôi cấy tế bào dùng (đĩa 96 giếng) Tổng số giếng nuôi cấy tế bào Tổng số giếng có tế bào lai Tỷ lệ % số giếng có tế bào lai/giếng ni cấy tế bào Tế bào Myeoloma Tế bào lympho B 1 2 x 107 2 x 108 8 768 740 96,35 2 2 x 107 2 x 108 8 768 696 90,63 3 2 x 107 2 x 108 8 768 728 94,79
Sử dụng tế bào Myeloma với số lượng 2 x 107 lai với tế bào Lympho B 2 x