ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.7. Thử nghiệm khả năng di động [1]
Nguyên tắc: Xác định xem một vi sinh vật có khả năng di động không
Phương pháp thử: Dùng kim lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA đã ủ 18-24
giờ ở 37oC cấy đâm xuyên vào tâm môi trường thạch mềm chứa trong ống nghiệm tới độ sâu khoảng 2cm. Ủ môi trường ở 37oC trong 24-48 giờ
Đọc kết quả:
-Di động: vi sinh vật di động rời khỏi đường cấy phân tán vào môi trường và làm đục môi trường
-Không di động: vi sinh vật chỉ phát triển dọc đường cấy, môi trường xung quanh vẫn trong.
2.2.2. Phương pháp hoá lý
2.2.2.1.Phương pháp xác định động thái sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang [12]
Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang. Theo phương pháp này số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem đo (trừ những mẫu có nồng độ tế bào đậm đặc), hay trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì tỉ lệ với nồng độ tế bào. Tuy nhiên lượng ánh sáng lọt vào bộ tách sóng quang ở mỗi máy đo mật độ quang bị quy định bởi hình dạng hình học của máy đó. Vì vậy đường cong chuẩn xác định mối liên quan giữa độ hấp thu và nồng độ tế bào phải được thiết lập riêng cho từng máy đo mật độ quang.
Độ hấp thu là số đo lượng sinh khối chứ không phải là số lượng tế bào. Kích thước tế bào thay đổi theo từng giai đoạn sinh trưởng vì thế xây dựng đường cong chuẩn cho máy đo mật độ quang với các tế bào ở giai đoạn tăng trưởng là tốt nhất. Kích thước tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào các môi trường nuôi cấy khác nhau. Kích thước tế bào càng nhỏ lại nếu môi trường càng nghèo dinh dưỡng vì vậy đường cong chuẩn phải được xây dựng theo từng môi trường nuôi cấy và từng chủng vi sinh vật riêng biệt.
Nếu mật độ tế bào quá cao, photon ánh sáng có thể bị một tế bào nào đó làm lệch hướng khỏi bộ tụ quang và quay trở lại bởi một tế bào khác, làm mất độ chính xác của độ hấp thu, đặc biệt là khi các giá trị độ hấp thu ở bước sóng 600nm lớn hơn 0.7. Vì vậy khi xác định mật độ tế bào bằng maý đo mật độ quang, dịch huyền phù tế bào cần phải được pha loãng đến những nồng độ thích hợp để có được độ hấp thu chính xác. Lưu ý rằng giá trị đo được cần nhân thêm với hệ số pha loãng.
2.2.2.2.Phương pháp đo pH
Sử dụng pH kế để đo pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn.
2.2.2.3.Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein [2][29]
Sử dụng tác nhân hoá học để chiết tách protein. Dung dịch nuôi cấy vi sinh vật được ly tâm lạnh 4 oC ở 16000 vòng trong 15 phút. Lấy dịch nổi bên trên cho kết tủa với 50% (NH4)SO4 bão hoà. Sau đó để qua đêm để kết tủa hoàn toàn. Ly tâm hỗn hợp 4 o C ở 16000 vòng trong 15 ph sau đó lọc lấy kết tủa, ta chiết tách được protein. Hoà tan protein bằng dung dịch photphat buffer. Dùng phương pháp điện di để xác đinh trọng lượng phân tử protein sau khi chiết tách.
2.2.3. Phương pháp khác điện di[51]
Nguyên lý SDS-PAGE: Kỹ thuật điện di SDS trên polyacrylamide gel
dựa trên nguyên lý dưới tác dụng của điện trường, các phân tử protein sẽ liên kết với các phân tử SDS có trong gel và di chuyển từ cực âm sang cực dương qua mạng lưới polyacrylamide gel. Sự phân tách này xảy ra nhờ điện tích của protein ở pH cho trước, kích thước của protein và sự cản trở của chúng trong quá trình dịch chuyển trong điện trường. Vì vậy, nếu các đặc điểm này bù trừ lẫn nhau thì protein khác điện tích và kích thước nhưng cũng có thể di chuyển cùng tốc độ như nhau trong gel. Để đơn giản hóa sự phân tách hỗn hợp protein mà chỉ phụ thuộc vào kích thước của chuỗi polypeptide, người ta tiến hành biến tính protein bằng thuốc tẩy sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS liên kết rất chặt với protein làm cấu trúc ba chiều của protein bị biến tính trở thành các chuỗi polypeptide gắn đầy SDS trên đó. Trung bình, một amino acid sẽ liên kết với hai phân tử SDS. Phân tử SDS lại tích điện âm nên điện tích của chuỗi polypeptide có gắn SDS âm nhiều hơn so với chuỗi không gắn SDS. Hơn nữa, tỷ lệ điện tích trên khối lượng của các phân tử protein được xem là
như nhau vì điện tích của protein chủ yếu do SDS quyết định. Do đó, sự phân tách các chuỗi polypeptide được biến tính bởi SDS sẽ hoàn toàn do kích thước của chuỗi quyết định.
Nhờ vào cấu trúc dạng mạng lưới của polyacrylamide gel mà các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau (hay cấu trúc không gian phức tạp khác nhau) lần lượt di chuyển qua lớp gel với tốc độ khác nhau và cuối cùng phân tách thành những băng protein có phân tử lượng khác nhau. Sau khi tiến hành nhuộm các băng protein trên polyacrylamide gel và rửa sạch thuốc nhuộm trên gel, dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của các băng này (cùng với các băng protein marker chuẩn), ta có thể xác định một cách định tính thành phần các loại protein cùng với sự thay đổi hàm lượng của chúng. Kỹ thuật này chủ yếu để kiểm tra sự xuất hiện các protein mới trong giống nghiên cứu.
Ngoài tác dụng phân tách các băng protein có khối lượng phân tử khác nhau. polyacrylamide gel còn được ứng dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước bé (< 200 bp).
