ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.Phương pháp vi sinh
2.2.1.Phương pháp vi sinh
2.2.1.1.Phương pháp phân lập vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng thập phân [9][10][11].
Đây là phương pháp nhằm phân lập vi sinh vật từ mẫu thử để chọn ra những khuẩn lạc thuần khiết.
Mẫu được sử dụng cho phân tích là nem chua, đã lên men trong 2-3 ngày. Phân tích mẫu trong điều kiện vô trùng. Các dụng cụ lấy mẫu đã được sấy vô trùng. Dùng kéo cắt 10g nem chua bổ sung 90ml nước muối sinh lý(0.85%) cho vào máy dập mẫu và tiến hành đồng nhất mẫu trong 60giây. Ta được dịch huyền phù có nồng độ 10-1. Từ dịch này tiếp tục pha loãng ra các dịch có nồng độ cao hơn 10-2 đến 10-7 bằng cách hút 1ml dịch ở nồng độ 10-1
, tiếp tục pha loãng ta có được các nồng độ cao hơn. Từ các ống nghiệm ở mỗi nồng độ trên hút 0.1ml cho vào các đĩa petri có chứa sẵn môi trường nuôi cấy chọn lọc (ở đây ta dùng MRS agar). Mỗi nồng độ được thực hiện trên 2 đĩa petri. Dùng que cấy trang dàn đều vi sinh vật trên đĩa môi trường. Nuôi các đĩa ở 30oC trong 48 giờ.
Sau thời gian nuôi ủ chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 CFU/g để đếm đồng thời chọn các đĩa có khuẩn lạc tách biệt nhau để đếm. Số lượng khuẩn lạc là trung bình cộng của 2 đĩa ở cùng nồng độ.
Từ các khuẩn lạc được phân lập ta chọn ra một số khuẩn lạc điển hình để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo.
2.2.1.2.Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp đối kháng đồng thời [23][33]
Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn được quan sát bằng việc khuếch tán vào môi trường chứa thạch. Chủng có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được nuôi ủ ở 30oC trong 48 giờ. Tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 10000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Dịch nổi bên trên được thu nhận và điều chỉnh đến pH 7 bằng NaOH 4M. Chuẩn bị các đĩa chứa môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient agar), các đĩa được dàn đều bởi 5ml thạch mềm chứa chủng chỉ thị (các chủng vi sinh vật dùng thử nghiệm tính đối kháng với vi khuẩn sinh bacteriocin). Để đông môi trường sau đó dùng khoan vô trùng tạo những giếng có đường kính 5mm trên đĩa thạch (có chủng chỉ thị) bằng cách bỏ agar đi. Cho 100 dịch nổi sau khi ly tâm và chỉnh pH vào các giếng. Nuôi ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ.
Bacteriocin được sinh tổng hợp nên sẽ khuếch tán vào môi trường và ức chế sự phát triển của các chủng chỉ thị. Điều này được thể hiện bởi vòng kháng khuẩn quanh giếng.