ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.4. Phương pháp thử catalase [1]
Nguyên tắc: nhằm xác định sự có mặt của enzym catalase
Cơ sở sinh hoá: Bởi oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang độc
tính đối với vi sinh vật, vi sinh vật cũng có thể tự giải độc bằng cách tạo ra những enzym có khả năng phá huỷ một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại enzym này là catalase. Enzym catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ nghi chứa cytochrome ngoại trừ Streptococcus spp.
Cả catalase và peroxidases đều được gọi dưới một tên chung là hydroperoxidase. Peroxidases là enzym thực vật, catalase có ở thực vật và động vật. Catalase là một hemeprotein, coenzyme của nó là hemin chứa bốn nguyên tử sắt III có khả năng chuyển hoá thuận nghịch giữa hai trạng thái oxy hoá và khử trong thời gian hoạt động. Có bằng chứng cho thấy một vài vi sinh vật có thể có enzym catalase không chứa sắt và hoạt tính catalase có thể yếu hoặc mạnh ở các lactobacillus khác nhau.
Hydrogen peroxide được hình thành như một sản phẩm cuối dạng oxy hoá của sự phân giải đường kiểu hiếu khí. Flavoprotein dạng khử phản ứng trực tiếp với khí oxy bằng cách khử điện tử tạo nên hydrogen peroxide :
FPH2 + O2 = FP + H2O2
FPH2: flavoprotein dạng khử FP: flavoprotein
H2O2: Hydrogen peroxide
Hydrogen peroxide khi tích tụ sẽ gây độc và làm chết vi sinh vật. Catalase có tác dụng phân giải H2O2 và oxy hoá các cơ chất thứ cấp khác song không phân giải các peroxide khác.
Phương pháp thử:
Hydrogen peroxide 30%
Dùng khoen cấy lấy khuẩn lạc đã được làm thuần trên môi trường không chọn lọc (TSA) đã nuôi ủ 18-24 giờ đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh trên lam.
Đọc kết quả:
Dương tính: có bóng khí xuất hiện tức thì (do tạo O2) Âm tính: không có bóng khí.
Sự có mặt của men catalase thể hiện ở việc tạo bóng khí trong phép thử.
2.2.1.5.Phương pháp thử khả năng lên men đường [1] [19]
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men một
carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản tạo nên axit.
Cơ sở sinh hoá: Việc sinh axit làm giảm pH thể hiện qua sự đổi màu của chất
chỉ thị pH có trong môi trường. Các sản phẩm cuối đặc trưng trong lên men là : axit lactic, axit formic, axit acetic, ethanol, axit butyric ..
Phương pháp thử :
Môi trường : Phenol red broth base pH 7.4. Chỉ thị pH: Phenol red . Trong môi trường axit chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng (pH 6.8). Trong môi trường kiềm chỉ thị phenol red giữ nguyên màu đỏ (pH 8.4)
Cấy khuẩn lạc đã được làm thuần trên môi trường Nutrient agar vào các ống phenol red có pha đường. Nồng độ đường sử dụng là 1%. Nuôi ủ các ống ở 37oC trong 18-24 giờ.
Đđọc kết quả:
- Dương tính (axit) :môi trường chuyển sang màu vàng - Âm tính: môi trường giữ nguyên màu đỏ.
2.2.1.6.Thử nghiệm Gram cải tiến [1]
Test KOH dùng để kiểm tra Gram âm và Gram dương của vi sinh vật. Đây là một phương pháp thay thế phương pháp nhuộm truyền thống trước đây.
Phương pháp thử: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 3% lên lam kính. Dùng
khuyên cấy lấy một phần khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc cho lên lam kính. Sau 5-10 lần nâng khuyên cấy lên xuống, theo dõi dây nhầy xuất hiện và đọc kết quả:
Gram âm (KOH dương tính): nếu có dây nhầy xuất hiện Gram dương (KOH âm tính): không có dây nhầy xuất hiện.
