6. Bố cục của luận văn
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚCVỀ CÂY VỐI
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Năm 1939, cụ Nguyễn Công Tiễu là ngƣời đầu tiên nghiên cứu cây vối
(Eugenia operculata Roxb. Cleistocalyx operculatatus Roxb. Merr. et Perry, họ Sim
Myrtaceae), đã báo cáo tại Hội nghị Thái Bình Dƣơng thứ 6 năm 1940.
Năm 1954, Andre Foucaud cũng đã nghiên cứu cây vối về mặt thực vật và hoá học trong luận án tiến sĩ dƣợc học “Góp phần nghiên cứu cây thuốc miền Bắc Việt Nam”.
Năm 1968, tác giả Nguyễn Đức Minh, phòng đông y thực nghiệm của Viện nghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tính chất kháng sinh của lá và nụ cây vối đối với một số vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) đã đi tới kết luận là ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây, lá và nụ vối đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông, tính kháng sinh cao nhất, tập trung nhiều nhất ở lá và hoàn toàn không độc với cơ thể con ngƣời.
Năm 1994, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào và Hoàng Văn Lựu đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu vối ở các địa phƣơng khác nhau của tỉnh Nghệ An đã công bố rằng trong nụ vối có chứa hàm lƣợng tinh dầu rất lớn. Các tinh dầu này có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxi hóa rất mạnh.
Năm 2003, Đào Thị Thanh Hiền, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội và các thành viên khác đã tiến hành thử nghiệm nghiên cứu một số tác dụng của cây lá cây vối. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy:
- Nƣớc sắc lá cây vối ủ có tác dụng lợi mật rất nhanh, kết quả này góp phần giải thích đƣợc vì sao nhân dân ta thƣờng uống nƣớc sắc lá cây vối để chữa đầy bụng và khó tiêu.
- Tính kháng khuẩn của lá cây vối, đặc biệt là lá cây vối ủ có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn E.coli, là loại vi khuẩn thƣờng gây ra bệnh đƣờng ruột, và hai vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) thƣờng gặp ở bệnh viên da. Điều này làm sáng tỏ việc uống nƣớc sắc lá cây vối để chữa bệnh tiêu chảy và tắm nƣớc sắc lá cây vối để chữa bệnh viêm da.
Kết quả thử tác dụng độc tế bào của mẫu chiết từ lá cây vối bƣớc đầu cho thấy cả tinh dầu và cao thô toàn phần đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ (ung thƣ tử cung, ung thƣ màng tim, ung thƣ gan,..). Điều này mở ra rất nhiều hƣớng nghiên cứu đối với cây dƣợc liệu lá cây vối trong tƣơng lai của các nhà khoa học.
Trong giai đoạn gần đây, tiêu biểu có công trình nghiên cứu của Viện Dinh dƣỡng Việt Nam kết hợp với trƣờng Đại học Phụ nữ Nhật Bản về các tác dụng của nụ vối trong hỗ trợ phòng và điều trị bệnh đái tháo đƣờng.
Sau gần 6 năm nghiên cứu, các nghiên cứu đƣợc tiến hành trên phòng thí nghiệm đến các thử nghiệm trên chuột đái tháo đƣờng đã cho thấy nụ vối có tác dụng bình ổn đƣờng huyết lâu dài, hỗ trợ giảm mỡ máu, chống oxy hóa, bảo vệ tổn thƣơng tế bào beta tuyến tụy, phòng ngừa đục thủy tinh thể ở bệnh đái tháo đƣờng. Hơn nữa, một thử nghiệm lâm sàng mới đây, với sự hợp tác nghiên cứu của Viện Dinh dƣỡng và Trƣờng Đại học Phụ nữ Nhật Bản tiến hành trên 72 bệnh nhân đái tháo đƣờng type 2 tại Hà Nội cho thấy, trà nụ vối (với liều 6g/lần uống) đã hạn chế tăng đƣờng huyết sau ăn của bệnh nhân đái tháo đƣờng. Sau khi uống trà nụ vối liên tục trong 3 tháng (ít nhất 4 - 6g nụ vối khô/lần uống; 3 lần/ngày), nhóm bệnh nhân uống trà nụ vối đã giảm đƣờng huyết xuống một cách đáng kể so với trƣớc khi tham gia, và giảm hơn so với nhóm chứng (nhóm không dùng nụ vối). Nồng độ HbA1c – chỉ số đánh giá sự ổn định về đƣờng huyết, nồng độ creatinin – chỉ số chức năng thận, nồng độ acid uric đã giảm xuống một cách có ý nghĩa thống kê ở nhóm bệnh nhân uống trà nụ vối. Nhóm uống nụ vối cũng đã giảm rối loạn lipid máu sau 3 tháng uống nụ vối, nồng độ cholesterol, triglyceride giảm, nồng độ HDL-cholesterol (cholesterol tốt) tăng lên một cách đáng kể so với nhóm chứng không uống nụ vối.
Các thử nghiệm trên ống nghiệm và trên động vật, trên bệnh nhân đái tháo đƣờng cho thấy, trà nụ vối có khả năng hạn chế tăng đƣờng huyết sau ăn và hỗ trợ ổn định đƣờng huyết, phòng ngừa biến chứng đái tháo đƣờng khi điều trị lâu dài. Kết quả nghiên cứu của Viện Dinh dƣỡng về nụ vối đã đƣợc đăng ký quyên sở hữu tại Cục Sở hữu trí tuệ Việt Nam, nghiên cứu đƣợc công bố năm 2010 [4], [17], [18], [19], [21].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
- Năm 1990, nhóm tác giả Zhang, Fengxian, Liumeifang, Lu Renrong (Trung Quốc) đã phân lập đƣợc một số chất trong lá, hoa và nụ vối sau:
Axit xinamic (C9H8O2) (5); axit galic (C7H6O5) (6); etylgalat(C9H10O5) (7); 7- hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavon (C18H18O4) (8); 2,4-dihidroxyl-6-metoxi-3,5- dimetylchacon (C18H18O4) (9); 5,7-dihidroxi-6,8-đimetylflavanon (C17H16O4) (10); axit oleanolic (C30H48O3) (11); axit ursolic(C30H48O3) (12); β-sitosterol (C27H40O) (13). (5) (6) (7) (8) (9) (10) OH O OH OH HO O OH
(11)
(12) (13)
- Năm 2002, một nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu về cây vối: nƣớc chiết của nụ vối là thành phần của nƣớc uống bổ dƣỡng trợ tim, làm giảm khả năng nhiễm bệnh [11], [16].
CHƢƠNG 2
NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng thực hiện
Trong luận văn này, tác giả chọn nguyên liệu là lá của cây vối (Cleistocalyx
operculatatus Roxb) đƣợc thu hái từ tháng 02/2017 đến tháng 03/2017 tại huyện Quế
Sơn của tỉnh Quảng Nam (Hình 2.1).
Hình 2.1. Lá cây vối lúc thu hái tại huyện Quế Sơn
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Lá của cây vối sau khi đƣợc loại bỏ những phần hƣ hại do sâu hoặc vàng úa, rửa sạch, phơi khô ở nhiệt độ từ 30 - 45oC cho đến khi hơi nƣớc bay hết và cho vào bao chứa, bảo quản lá cây vối nơi khô ráo. Chú ý tránh để hiện tƣợng lá cây vối bị úng hoặc phơi quá khô sẽ làm hao tổn hàm lƣợng tinh dầu có trong lá cây vối, còn đối với việc sử dụng các dung môi để chiết tách các hợp chất hữu cơ thì ta phải sấy cho lá cây vối khô.
Hình 2.2. Lá cây vối sau khi đƣợc xử lý
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy Controller B170 của Đức, sấy ở khoảng nhiệt độ từ 30-280oC. - Cân phân tích satorius CP224S.
- Thiết bị chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc (phòng thí nghiệm B7 khoa Hóa, trƣờng Đại học Sƣ Phạm).
- Khúc xạ kế Atago RX-5000 Alpha (phòng thí nghiệm thuộc khoa Hóa, trƣờng Đại học Bách khoa Đà Nẵng).
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 800 hãng Perkin Elmer của Trung tâm Kỹ thuật–Tiêu chuẩn-Đo Lƣờng chất lƣợng 2, 02 Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng.
- Bộ chiết Soxhlet (phòng thí nghiệm B4 khoa Hóa, trƣờng Đại học Sƣ phạm). - Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C. Cột sắc kí HP5MS (dài 30m; đƣờng kính trong 0.25mm; lớp phim dày 0.25µm) tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế - 17 Trƣơng Định, thành phố Huế.
- Máy cất quay chân không Buchi- Vacuum Controller V-800. - Thiết bị sắc ký cột và sắc ký bản mỏng TLC Sillica gel 60 F254;
- Các dụng cụ thí nghiệm khác nhƣ: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc,...
2.2.2. Hóa chất
Một số loại hóa chất đƣợc sử dụng chính để làm đề tài này nêu trong Bảng 2.1. Ngoài ra, tác giả còn sử dụng thêm các loại hóa chất khác nhƣ: Sillica gel, H2SO4 đặc, HNO3, C2H5OH tuyệt đối, Na2SO4 khan, nƣớc cất, phenolphtalein, …
Bảng 2.1. Danh mục các hóa chất chính đƣợc sử dụng TT Tên hóa chất Xuất xứ Đặc điểm 01 n-Hexane C6H14 Trung Quốc
M = 86.16 g/mol; chất lỏng không màu; không tan trong nƣớc; d = 0.6548 g/ml; t0 nc = -950C; t0s = 690C 02 Dichlorome- thane CH2Cl2 Trung Quốc
M = 84.93 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nƣớc 1.3g/100ml ở 200 C; d = 1.3255 g/ml; t0nc = -96,70C; t0s = 390C. 03 Ethyl acetate C4H8O2 Trung Quốc
M = 88.11 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nƣớc 8.3g/100ml ở 200 C; d = 0.8897 g/ml; t0nc = -840C; t0s = 770C. 04 Methanol CH3OH Trung Quốc
M = 32.04 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nƣớc vô hạn ở 200C; d = 0,7918 g/ml; tonc = -
97,60C; t0s = 64,70C
2.3. PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.3.1. Phƣơng pháp xác định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng là phƣơng pháp phân tích định lƣợng dựa vào kết quả cân khối lƣợng của sản phẩm đƣợc hình thành sau phản ứng kết tủa bằng phƣơng pháp hóa học hay phƣơng pháp vật lý. Do chất phân tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân, ta dễ dàng suy ra khối lƣợng chất phân tích trong đối tƣợng phân tích.
Quá trình phân tích một chất theo phƣơng pháp trọng lƣợng: - Chọn mẫu và gia công mẫu.
- Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dƣới trạng thái tinh khiết hóa học. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện đƣợc, do đó, chất cần xác định thƣờng đƣợc tách ra ở dạng hợp chất kết tủa sau phản ứng và có thành phần xác định. Để làm đƣợc điều đó, ta thực hiện nhƣ sau:
+ Đƣa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch (làm phản ứng kết tủa hay điện phân).
+ Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy…) rồi đem cân để tính kết quả.
b. Phương pháp vật lý
+ Xác định hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu được xác định phương pháp quang phổ hấp th nguyên tử (AAS).
Đặc điểm của phổ AAS
Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bƣớc sóng xác định vào đám hơi nguyên tử thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bƣớc sóng tƣơng ứng đúng với những tia bức xạ mà có thể phát ra đƣợc trong quá trình phát xạ. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Nghiên cứu sự phụ thuộc cƣờng độ một số vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố vào nồng độ (C) của nguyên tố đó trong mẫu phân tích, ngƣời ta nhận thấy trong vùng nồng độ nhỏ, mối quan hệ giữa cƣờng độ vạch phổ hấp thụ và số nguyên tử của nguyên tố tuân theo định luật Lambert - Beer: D = lC. Trong đó:
C- là nồng độ dung dịch, đo bằng mol/l
l - là bề dày của cuvét đựng dung dịch, đo bằng cm
ε - đƣợc gọi là hệ số tắt phân tử hay hệ số hấp thụ phân tử. ε là đại lƣợng xác định, phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ, vào bƣớc sóng λ của bức xạ điện từ.
Nguyên tắc của phép đo AAS
Trên nguyên tắc để xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử, nó chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và trong mức năng lƣợng cơ bản. Do vậy, muốn thực hiện đƣợc phép đo AAS cần phải thực hiện theo các bƣớc sau:
1. Hóa hơi mẫu phân tích, đƣa vật mẫu về trạng thái khí.
2. Nguyên tử hóa đám hơi đó, tức là phân ly các phân tử để tạo ra các đám hơi các nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích có trong mẫu và có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc. Hai công việc này đƣợc gọi là quá trình nguyên tử hóa mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và ảnh hƣởng đến quyết định kết quả của phép đo AAS, vì nó tạo ra môi trƣờng hấp thụ nguyên tử của phép đo.
3. Chọn nguồn phát tia sáng đơn sắc, có cƣờng độ cao, có bƣớc sóng phù hợp nhạy với nguyên tố phân tích (bức xạ cộng hƣởng) và chiếu vào đám hơi đó, nhƣ vậy phổ hấp thụ sẽ xuất hiện.
4. Thu toàn bộ chùm sáng sau khi đi qua môi trƣờng hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn 1 vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích để hƣớng vào khe đo, để đo cƣờng độ của nó.
5. Thu và ghi lại kết quả đo của cƣờng độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị ghi và xử lý thích hợp.
+ Đánh giá cảm quan và xác định tính chất vật lý của mẫu tinh dầu nghiên cứu:
- Đánh giá cảm quan: là phân tích sơ bộ để đánh giá chất lƣợng tinh dầu bằng cảm quan nhƣ: màu sắc, mùi, vị, độ trong suốt,… Việc đánh giá cảm quan tinh dầu vối đƣợc thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 189:1993.
- Xác định tính chất vật lý:
Chỉ số khúc xạ (n) của một chất so với không khí là tỷ lệ giữa sin của góc tới và sin của góc khúc xạ của chùm tia sáng truyền từ không khí vào chất đó. Chỉ số khúc xạ thay đổi theo bƣớc sóng ánh sáng đƣợc dùng để đo và nhiệt độ. Chỉ số khúc xạ có giá trị để định tính và phát hiện tạp chất trong mẫu tinh dầu vối.
Việc xác định chỉ số khúc xạ đƣợc tiến hành trên Khúc xạ kế kiểu Abbe hoặc kiểu khác có đèn natri hay các bộ phân bổ chính triệt tiêu hiện tƣợng tán sắc và cho phép đọc đƣợc chỉ số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với độ chính xác ± 0,0002;
Tỉ trọng tinh dầu lá cây vối là tỉ số của khối lƣợng tinh dầu ở 200C với khối lƣợng của cùng một thể tích nƣớc cất cũng ở 200C.
2.3.2. Phƣơng pháp chiết mẫu lá cây vối bằng các dung môi hữu cơ
Lá cây vối đã đƣợc sấy khô và nghiền nhỏ, sau đó ta tiến hành chiết lần lƣợt với từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau nhƣ sau: n–hexane, dichloromethane, ethyl acetate và methanol.
Cách tiến hành
- Chuẩn bị bộ chiết Soxhlet 500ml, rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sấy khô. - Cân khoảng 20g bột nguyên liệu lá cây vối, ta có khối lƣợng (m1), cho vào túi vải, sau đó cho vào thiết bị chiết của bộ chiết soxlhlet. Lấy chính xác 125ml dung môi chiết cho vào bình cầu. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của các dung môi trong các khoảng thời gian nhƣ sau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ và 12 giờ.
- Tiến hành đo khối lƣợng của dung môi chiết bằng cách, hút chính xác 50ml dung môi chiết cho vào bình tỉ trọng cân đƣợc khối lƣợng dung môi là mdm.
- Đối với mỗi mẫu sau khi chiết xong, tiến hành đo chính xác thể tích (V) dịch chiết thu đƣợc. Cô đuổi dung môi trong dịch chiết đến thể tích nhất định và cho vào bình định mức 50ml. Cân thu đƣợc khối lƣợng dịch chiết là mdc. Tính toán suy ra đƣợc khối lƣợng chất tan là mct của dịch chiết.
1 10 dc dm ct m m m m (2.1) Trong đó
- mdm là khối lƣợng của 50ml dung môi.
- mdc là khối lƣợng 50ml dịch chiết thu đƣợc sau khi chiết với thời gian khảo sát đã làm bay hơi dung môi.
- mct là khối lƣợng chất tan có trong 20g dịch chiết.
2.3.3. Phƣơng pháp chƣng cất tinh dầu lá cây vối
Theo phƣơng pháp của Dƣợc điển Việt Nam I: Chƣng cất hơi nƣớc nguyên liệu tƣơi trong thiết bị chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, ống sinh hàn hồi lƣu và bình hứng hai ngành đƣợc cắm vào nút cao su của ống sinh hàn. Nguyên tắc trích li này dựa vào sự hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nƣớc của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nƣớc ở nhiệt độ cao. Sự
khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trƣơng phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nƣớc bão hòa trong một thời gian nhất định.
Trong đề tài này, do những đặc tính của tinh dầu lá cây vối đó là: dễ bay hơi, lôi cuốn theo hơi nƣớc ở nhiệt độ khoảng 1000C, hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ và dễ bị hấp thụ ngay ở thể khí, nên phƣơng pháp để sản xuất tinh dầu lá cây