6. Cấu trúc của luận văn
2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
a. Nguyên liệu
Vỏ quả và lá bứa (Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth.) được thu hái tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, Thành phố Đà Nẵng.
b. Thu nguyên liệu
Chọn các loại quả chín có vỏ màu vàng, mềm, ít nhựa, dễ dùng dao tách lấy vỏ. Cơm bao quanh hạt dày, rõ ràng, màu trắng vàng. Với lá bứa chọn những lá tươi xanh, nhẵn, tương đối đều nhau về hình dạng và kích thước.
c. Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất. Do đó, giai đoạn làm sạch nguyên liệu càng cẩn thận thì hiệu quả của các quá trình chiết tách sau này càng cao. Tiến hành xử lý nguyên liệu theo phương pháp thủ công. Đầu tiên, nguyên liệu quả được thu nhận về cần loại bỏ những quả bị hư tổn, quả xanh, loại bỏ hết bụi bẩn, tạp chất bằng cách rửa với nước và lau khô bằng vải sạch. Sau khi khô nước, cắt bỏ cuống quả, tách bỏ ruột chỉ lấy phần vỏ, tiến hành làm sạch ruột và phơi khô phần vỏ của quả. Vỏ quả bứa đem sấy khô rồi xay thành bột.
Lá bứa cũng xử lý tương tự như vỏ bứa, nguyên liệu sau khi loại bỏ tạp chất thì được hong khô, sau đó xay thành bột.
Nguyên liệu bột khô sau khi xử lý thì được bảo quản cẩn thận.
2.1.2. Hóa chất
Những hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này là những hóa chất có độ tinh khiết cao, sử dụng trong phân tích, được mua của hãng Merk và Trung
Quốc. Các dụng cụ và hóa chất thuộc phòng thí nghiệm khoa Hóa – Đại học Sư Phạm – ĐH Đà Nẵng.
- H2SO4, Trung Quốc - C6H8O7, Trung Quốc
- HCl, Trung Quốc - C6H5Na3O7, Trung Quốc
- CH3COOH, Trung Quốc - CaCl2, Merk, Đức
- HNO3, Trung Quốc - NaOH, Trung Quốc
- H3PO4, Trung Quốc - C2H5OH, Trung Quốc
- Than hoạt tính, chỉ thị xanh metylen, phenolphthalein, hồ tinh bột - Và một số hóa chất thông dụng khác
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Máy phân tích phổ FT-IR. Phổ ghi theo kỹ thuật ép viên với KBr đo trên thiết bị của Trung Tâm Kỹ Thuật 2 – Tp. Đà Nẵng.
- Máy đo pH
- Cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh - Bếp cách thủy
- Phễu buchner
Ngoài ra còn có các thiết bị, dụng cụ thủy tinh thông thường trong phòng thí nghiệm như: cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp đun bình cầu, cốc sứ, các loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc, bông gòn, …
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp vật lý
v Nguyên tắc
Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lượng không đổi.
v Cơ sở của phương pháp
Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và chất bay hơi tự do: m = mo+ w.
Trong đó,
- m: khối lượng chung của nguyên liệu. - mo: khối lượng của chất khô tuyệt đối. - w: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
v Áp dụng phương pháp này
- Xác định độ ẩm.
- Xác định hàm lượng tro.
a. Xác định độẩm.
Dùng nhiệt để làm bay hết hơi nước trong mẫu đến trọng lượng không đổi. Hàm lượng nước được tính toán dựa trên khối lượng mất đi trong quá trình sấy. Cân trọng lượng của nguyên liệu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong nguyên liệu.
ü Dụng cụ và thiết bị sử dụng
Cốc sứ đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
ü Cách tiến hành
Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu bột vỏ bứa và lấy kết quả trung bình. Chuẩn bị các cốc có kí hiệu sẵn 5 mẫu, cốc được rửa sạch và sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lượng không đổi m1.
Cân lượng bột vỏ bứa khô chính xác m2 trên cân phân tích, cho vào các cốc đã chuẩn bị sẵn và sấy ở 950- 1100C. Cứ sau 3h, lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lượng cốc và mẫu không đổi m3.
Khối lượng ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3. Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lượng hạt ban đầu.
ü Công thức tính độ ẩm của mỗi mẫu: % , 100 ) ( % 2 3 2 1 + - ´ = m m m m W Độ ẩm trung bình: 5 (%) 5 1 å = W WTB Trong đó, - m1: khối lượng cốc, (g).
- m2: khối lượng nguyên liệu, (g).
- m3: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy, (g). - W: độ ẩm của mỗi mẫu, (%).
- WTB: độ ẩm trung bình, (%).
b. Xác định hàm lượng tro.
ü Cách tiến hành
Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu bột vỏ bứa và lấy kết quả trung bình. Các mẫu bột vỏ quả bứa (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để tro hoá. Các mẫu được đốt trên bếp điện, than hoá sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 5000- 5500C trong thời gian từ 4-6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng m4. Khối lượng tro là phần chất còn lại sau khi nung.
Tiến hành thí nghiệm tương tự để xác định hàm lượng tro của bột lá bứa.
ü Công thức tính %Tro 100,% 2 4 3 - ´ = m m m
Lượng tro trung bình %Tro trung bình 4 % 4 1 å = Tro Trong đó,
- m2: khối lượng nguyên liệu ban đầu, (g).
- m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi xác định độ ẩm, (g). - m4: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hoá, (g).
2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS)
ü Nguyên tắc
Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không hấp thụ hay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản. Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử. Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó, thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc đó nguyên tử đã nhận năng lượng dưới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [10].
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lượng và tạo ra phổ hấp thụ
nguyên tử của nó.
Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi. Vì vậy muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bước sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hoá hơi mẫu phân tích, đưa về trạng thái khí. Mục đích của quá trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích. Có thể nguyên tử hoá mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc bằng kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa. Đây là giai đoạn quan trọng và có ảnh hưởng đến kết quả phép đo AAS.
- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tử. Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích hướng vào khe đo để đo cường độ của nó.
- Ghi nhận tín hiệu đo và kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp.
Sử dụng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định hàm lượng các kim loại trong vỏ quả và lá bứa khô.
ü Cách tiến hành
Dùng cân phân tích cân chính xác từ 1g mẫu, cho vào chén sứ nung ở 7000C trong 6 giờ đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng.Trường hợp mẫu khô nhưng chưa có màu trắng, ta thêm 2- 3 giọt HNO3 vào; tiếp tục nung cho đến khi khô và xuất hiện màu trắng. Để nguội chén sứ, đem định mức thành 50ml bằng nước cất rồi tiến hành đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ quả bứa khô.
2.2.3. Phương pháp hóa học
Xác định hàm lượng vitamin C trong vỏ và lá bứa bằng phương pháp oxy hóa bằng dung dịch I2 với chỉ thị là dung dịch tinh bột [1].
ü Nguyên tắc
Axit L-ascorbic (vitamin C) có tính khử mạnh được oxy hóa bằng dung dịch I2 với chỉ thị là dung dịch tinh bột. Điểm kết thúc của phản ứng nhận biết được nhờ chỉ thị dung dịch tinh bột.
ü Cách tiến hành
Cân 2g nguyên liệu xay hòa tan trong 150ml nước cất, đem lọc lấy dung dịch, chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml và thêm nước đến vạch.
Lấy 100ml dung dịch lọc cho vào bình tam giác 250ml, cho 50ml dung dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N cho tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh, ghi lại thể tích dung dịch I2.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
ü Công thức tính kết quả:
Trong đó,
- C: hàm lượng axit ascorbic, (%).
- n: số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ, (ml). - V: tổng thể tích định mức, (ml).
- v: số ml dung dịch nguyên liệu đã lấy đi để phân tích, (ml).
2.2.4. Phương pháp hóa sinh
a. Xác định hàm lượng đường khử trong vỏ và lá bứa
Xác định hàm lượng đường khử trong vỏ và lá bứa bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với ferrycyanure [1].
ü Nguyên tắc
Khi cho ferrycyanure (K3Fe(CN)6) phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là ferrocyanure. Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến
hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen . Phương trình phản ứng:
CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH
à CH2OH-(CHOH)4-COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O
ü Cách tiến hành
Xử lý nguyên liệu: cân 2g nguyên liệu khô. Trích ly đường nhiều lần bằng nước cất nóng ở nhiệt độ 70-800C. Sau đó cho hỗn hợp vào bình định mức 100ml để trích ly, lắc đều trong 10 phút, định mức tới vạch và đem lọc. Sau khi lọc, lấy dung dịch mẫu chứa đường khử, cho vào buret.
Cho vào bình nón 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2,5ml dung dịch NaOH 2,5N. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử từ burette, cho từng giọt, lắc mạnh. Dung dịch ban đầu có màu vàng biến mất, dung dịch trong suốt không màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure. Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ giọt chỉ thị xanh metylen và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai. Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối.
Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi. Lặp lại thí nghiệm chuẩn độ 3 lần.
Tiến hành thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucozơ 0,5%. Thay lượng đường khử trên buret bằng dung dịch glucozơ chuẩn 0,5% và chuẩn độ tương tự.
ü Cách tính toán kết quả
Trong thí nghiệm, Vk là thể tích dung dịch mẫu và Vg là thể tích dung dịch glucozơ 0,5% cùng phản ứng với một dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định. Như vậy, Vk là thể tích dung dịch mẫu tương ứng với Vg là thể tích dung dịch glucozơ 0,5% có (0,5 x Vg)/100g glucozơ.
Lượng đường khử được tính bằng công thức:
Trong đó,
- Xk: lượng đường khử, (%).
- Vg: thể tích dung dịch glucozơ 0,5% cho chuẩn độ, (ml). - Vk: thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, (ml). - V: thể tích bình định mức, (ml).
- m: lượng mẫu thí nghiệm, (g).
b. Xác định hàm lượng xenlulozơ trong vỏ và lá bứa
Hàm lượng xenlulozơ được xác định theo phương pháp thủy phân bằng axit mạnh [1].
ü Nguyên tắc
Sử dụng kiềm và natri hypoclorit (NaClO) loại bỏ các chất lignin, hemixenlulozơ, tro...để thu hồi xenlulozơ. Kỹ thuật này không ảnh hưởng gì đến xenlulozơ ngay cả những phân tử thấp nhất.
ü Cách tiến hành
Cân chính xác 2g nguyên liệu cho vào bình cầu dung tích 500ml cùng với 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn ngược hồi lưu và đun sôi nhẹ trong thời gian 30 phút kể từ lúc sôi. Sau đó, lọc và thu lấy bã xenlulozơ. Cho bã xenlulozơ tác dụng với 10ml dung dịch HCl 10% trong bình cầu ở nhiệt độ thường, thêm 10ml dung dịch natri hypochlorit (NaClO) từng giọt
một, vừa cho vừa khuấy đều, để yên trong 5 phút rồi lọc. Tiếp tục cho bã xenlulozơ tác dụng trở lại với dung dịch NaOH 0,5% ở nhiệt độ 400C để yên trong vài phút và lọc. Làm như vậy một, hai lần nữa để có xenlulozơ thật trắng. Rửa thật kĩ bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi.
ü Công thức tính kết quả
Hàm lượng xenlulozơ được tính theo công thức sau: X = mm2
1 x 100, % Trong đó,
- X: hàm lượng xenlulozơ, (%). - m1: khối lượng nguyên liệu, (g). - m2: khối lượng xenlulozơ, (g).
c. Xác định hàm lượng protein trong vỏ quả và lá bứa
Hàm lượng protein trong vỏ và lá bứa được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kjeldahl. Hàm lượng nitơ trung bình trong phân tử protein là 16% vì vậy hàm lượng protein bằng hàm lượng nitơ toàn phần nhân với hệ số 6,25 [1].
ü Nguyên tắc
Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa. Cacbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
2NH3 + H2SO4à (NH4)2SO4
Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH theo phản ứng: (NH4)2SO4 + 2NaOH à Na2SO4 + H2O + 2NH3
Đồng thời cất và thu NH3 bằng lượng dư H2SO4 0,1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên
liệu thí nghiệm.
ü Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vô cơ hóa mẫu:
Tiến hành trong tủ Hotte
Lấy mẫu cho vào bình Kjeldahl. Cân chính xác 2g nguyên liệu (vỏ hoặc lá bứa), thêm vào từ từ 20ml H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1,84). Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm một ít xúc tác. Cho 10g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4: K2SO4 (1:3). Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốc phản ứng. Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho