6. Cấu trúc của luận văn
2.2.4. Phương pháp hóa sinh
a. Xác định hàm lượng đường khử trong vỏ và lá bứa
Xác định hàm lượng đường khử trong vỏ và lá bứa bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với ferrycyanure [1].
ü Nguyên tắc
Khi cho ferrycyanure (K3Fe(CN)6) phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là ferrocyanure. Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến
hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen . Phương trình phản ứng:
CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH
à CH2OH-(CHOH)4-COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O
ü Cách tiến hành
Xử lý nguyên liệu: cân 2g nguyên liệu khô. Trích ly đường nhiều lần bằng nước cất nóng ở nhiệt độ 70-800C. Sau đó cho hỗn hợp vào bình định mức 100ml để trích ly, lắc đều trong 10 phút, định mức tới vạch và đem lọc. Sau khi lọc, lấy dung dịch mẫu chứa đường khử, cho vào buret.
Cho vào bình nón 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2,5ml dung dịch NaOH 2,5N. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử từ burette, cho từng giọt, lắc mạnh. Dung dịch ban đầu có màu vàng biến mất, dung dịch trong suốt không màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure. Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ giọt chỉ thị xanh metylen và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc.
Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai. Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối.
Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi. Lặp lại thí nghiệm chuẩn độ 3 lần.
Tiến hành thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucozơ 0,5%. Thay lượng đường khử trên buret bằng dung dịch glucozơ chuẩn 0,5% và chuẩn độ tương tự.
ü Cách tính toán kết quả
Trong thí nghiệm, Vk là thể tích dung dịch mẫu và Vg là thể tích dung dịch glucozơ 0,5% cùng phản ứng với một dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định. Như vậy, Vk là thể tích dung dịch mẫu tương ứng với Vg là thể tích dung dịch glucozơ 0,5% có (0,5 x Vg)/100g glucozơ.
Lượng đường khử được tính bằng công thức:
Trong đó,
- Xk: lượng đường khử, (%).
- Vg: thể tích dung dịch glucozơ 0,5% cho chuẩn độ, (ml). - Vk: thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, (ml). - V: thể tích bình định mức, (ml).
- m: lượng mẫu thí nghiệm, (g).
b. Xác định hàm lượng xenlulozơ trong vỏ và lá bứa
Hàm lượng xenlulozơ được xác định theo phương pháp thủy phân bằng axit mạnh [1].
ü Nguyên tắc
Sử dụng kiềm và natri hypoclorit (NaClO) loại bỏ các chất lignin, hemixenlulozơ, tro...để thu hồi xenlulozơ. Kỹ thuật này không ảnh hưởng gì đến xenlulozơ ngay cả những phân tử thấp nhất.
ü Cách tiến hành
Cân chính xác 2g nguyên liệu cho vào bình cầu dung tích 500ml cùng với 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn ngược hồi lưu và đun sôi nhẹ trong thời gian 30 phút kể từ lúc sôi. Sau đó, lọc và thu lấy bã xenlulozơ. Cho bã xenlulozơ tác dụng với 10ml dung dịch HCl 10% trong bình cầu ở nhiệt độ thường, thêm 10ml dung dịch natri hypochlorit (NaClO) từng giọt
một, vừa cho vừa khuấy đều, để yên trong 5 phút rồi lọc. Tiếp tục cho bã xenlulozơ tác dụng trở lại với dung dịch NaOH 0,5% ở nhiệt độ 400C để yên trong vài phút và lọc. Làm như vậy một, hai lần nữa để có xenlulozơ thật trắng. Rửa thật kĩ bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi.
ü Công thức tính kết quả
Hàm lượng xenlulozơ được tính theo công thức sau: X = mm2
1 x 100, % Trong đó,
- X: hàm lượng xenlulozơ, (%). - m1: khối lượng nguyên liệu, (g). - m2: khối lượng xenlulozơ, (g).
c. Xác định hàm lượng protein trong vỏ quả và lá bứa
Hàm lượng protein trong vỏ và lá bứa được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kjeldahl. Hàm lượng nitơ trung bình trong phân tử protein là 16% vì vậy hàm lượng protein bằng hàm lượng nitơ toàn phần nhân với hệ số 6,25 [1].
ü Nguyên tắc
Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa. Cacbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
2NH3 + H2SO4à (NH4)2SO4
Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH theo phản ứng: (NH4)2SO4 + 2NaOH à Na2SO4 + H2O + 2NH3
Đồng thời cất và thu NH3 bằng lượng dư H2SO4 0,1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên
liệu thí nghiệm.
ü Cách tiến hành
Vô cơ hóa mẫu:
Tiến hành trong tủ Hotte
Lấy mẫu cho vào bình Kjeldahl. Cân chính xác 2g nguyên liệu (vỏ hoặc lá bứa), thêm vào từ từ 20ml H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1,84). Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm một ít xúc tác. Cho 10g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4: K2SO4 (1:3). Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốc phản ứng. Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng.
Cất đạm:
Tiến hành toàn bộ cất đạm Gerhardt của Đức
Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl vào bình định mức 250ml (chú ý lúc này trong bình Kjeldahl còn dư một lượng H2SO4 đậm đặc trong dung dịch mẫu của quá trình vô cơ hóa nên phải cho trước một ít nước cất vào bình định mức trước khi đổ dung dịch mẫu vào), thêm nước cất cho đến vạch định mức. Lúc này nhiệt tỏa ra rất mạnh là nước bay hơi một phần. Làm nguội bình định mức và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ ra bình định mức và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ ra bình tam giác để dễ lắc trộn dung dịch mẫu đồng đều. Hút 40ml dịch này đi cất.
Mặt khác hút 15ml dung dịch H2SO4 cho vào bình tam giác 250ml, cộng thêm 5-10ml nước và 3 giọt phenolphtalein rồi đặt bình vào vị trí làm việc. Khi hết thời gian cất đạm, lấy bình tam giác ra đem chuẩn độ để xác định lượng H2SO4 0,1N thừa.
Chuẩn độ
Lấy bình tam giác ra sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N.
ü Tính kết quả
Hàm lượng protein được tính bằng công thức:
Trong đó,
- N: hàm lượng nitơ tính bằng phần trăm khối lượng, (%). - a: số ml dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3, (ml). - b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ, (ml).
- m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, (g).
- V: tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa, (ml). - v: tổng thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất, (ml).
d. Xác định hàm lượng pectin
Hàm lượng pectin trong vỏ quả và lá bứa khô được xác định bằng phương pháp canxi pectat [1].
ü Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm loãng, pectin hòa tan sẽ giải phóng ra nhóm metoxyl thành rượu metylic và axit pectic tự do. Axit pectic tự do trong môi trường có mặt axit axetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat. Từ hàm lượng muối kết tủa có thể tính được hàm lượng pectin có trong mẫu phân tích.
ü Cách tiến hành
Cân 2g nguyên liệu xay cho vào 500 ml dung dịch axit citric 0,1N, đun cách thủy ở 900C trong vòng 1 giờ, thêm nước cất đủ thể tích bằng 500ml. Lọc dung dịch và cho vào bình nón khô sạch. Lấy 100ml dung dịch lọc cho vào
bình tam giác rồi cho thêm 500ml NaOH 0,1N để yên trong 7h (có thể để qua đêm). Sau đó thêm 250ml dung dịch CH3COOH 1N, sau 5 phút thêm 250ml dung dịch CaCl2 2N để yên trong 1 giờ. Đem đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho đến khi nước rửa không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử Cl-). Sau khi sạch kết tủa, cho giấy lọc kết tủa vào chén cân và sấy khô ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy lọc và giấy lọc có kết tủa cho ta biết được trọng lượng của canxi pectat.
Vì hàm lượng canxi trong canxi pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng canxi pectat với 0,92.
ü Tính kết quả
Hàm lượng pectin tính theo công thức:
Trong đó,
- B: trọng lượng canxi pectat, (g).
- V: tổng thể tích dung dịch chiết được, (ml). - v: thể tích dung dịch đem đi xác định, (ml). - m: trọng lượng mẫu, (g).
e. Một số phương pháp chiết tách pectin từ nguyên liệu
* Phương pháp chưng ninh
ü Nguyên tắc
Phương pháp chưng ninh là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Đây là một trong những phương pháp chiết tách đơn giản nhất. Có thể chưng ninh từ hỗn hợp dung dịch hoặc từ chất rắn. Có thể dùng bình cầu có sinh hàn hồi lưu, hay dùng nồi áp suất để chưng ninh.
Đun nóng hợp chất với dung môi trong nồi áp suất trong khoảng thời gian nhất định thu được dịch chiết có lẫn bã rắn. Lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi lọc bỏ bã rắn, sẽ thu được dịch chiết. Tuy là phương pháp đơn giản nhưng việc lựa chọn dung môi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung môi sử dụng phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, không hòa tan hay hòa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu bắt buộc phải có.
- Không tương tác với các cấu tử hóa học cần chiết tách.
- Không gây độc hại cho người sử dụng và môi trường xung quanh. - Dễ kiếm, giá thành rẻ, thân thiện với môi trường.
- Không có tương tác, phá hủy dụng cụ chiết tách,...
Dùng phương pháp chưng ninh trong nồi áp suất để chiết tách axit hydroxycitric và pectin có trong mẫu bột vỏ và lá bứa sấy khô.
* Phương pháp chiết Soxhlet
Chiết nhiều lần có ưu điểm chiết kiệt hơn 1 lần. Trong trường hợp này ta thường sử dụng ống Soxhlet. Nó bao gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lưu. Dung môi ở trong bình cầu được làm bốc hơi từng phần, dung môi được ngưng tụ nhỏ vào chất được chiết đựng trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó lại chảy vào bình. Trong quá trình đó cấu tử cần được tách được làm giàu thêm trong dung môi ở bình cầu.
Dùng phương pháp chiết Soxhlet để chiết tách axit hydroxycitric có trong mẫu vỏ quả bứa với dung môi metanol.
f. Phương pháp kết tủa pectin từ nguyên liệu
ü Nguyên tắc
Pectin có trong dịch chiết HCA từ nguyên liệu vỏ và lá bứa. Đây là hợp chất polisaccarit không tan trong các dung môi: propanol, cồn, axeton, dung môi hữu cơ…Vậy chúng ta có thể nghiên cứu để sử dụng hiệu quả những
dung môi đó để tách loại pectin từ dịch chiết HCA.
Sản phẩm pectin thu nhận được với ý nghĩa ứng dụng làm phụ gia trong công nghệ thực phẩm nên các dung môi sử dụng để kết tủa pectin phải an toàn và có hiệu quả kinh tế. Trong đề tài này, chúng tôi lựa chọn dung môi cồn để kết tủa pectin.
ü Cách tiến hành
Nguyên liệu được xay nhỏ trong dung môi, sau đó tiến hành trích ly pectin trong một khoảng thời gian. Sau đó lọc ép lấy dịch, tiếp tục cô đặc dung dịch cho bớt nước và kết tủa dung dịch bằng cồn. Lọc kết tủa, rửa lại bằng cồn rồi sấy khô. Sản phẩm sau khi sấy được nghiền nhỏ, thu được bột pectin thô (chế phẩm pectin).
g. Phương pháp định lượng pectin thực trong mẫu pectin thô
ü Nguyên tắc
Dung dịch pectin thô tác dụng với dung dịch kiềm nhằm mục đích chuyển pectin hòa tan thành rượu metylic và axit pectic tự do. Axit pectic tự do trong môi trường có mặt axit axetic kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat. Từ hàm lượng muối kết tủa có thể tính được hàm lượng pectin thực [1].
ü Cách tiến hành
Cân 1 g pectin thô hòa tan trong 100ml nước cất, ta được dung dịch pectin. Hút 20ml dung dịch này cho vào bình tam giác rồi cho thêm 100ml NaOH 0,1N để yên trong 7 giờ (có thể qua đêm). Sau đó thêm 50ml dung dịch CaCl2 2N để yên trong 1 giờ. Đem đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho đến khi nước rửa không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử Cl-). Sau khi sạch kết tủa, cho giấy lọc kết tủa vào chén cân và sấy khô ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy
lọc và giấy lọc có kết tủa cho ta biết được trọng lượng của canxi pectat.
Vì hàm lượng canxi trong canxi pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng canxi pectat với 0,92.
ü Công thức tính kết quả
Hàm lượng pectin tính theo công thức:
Trong đó,
- B: trọng lượng canxi pectat, (g).
- V: tổng thể tích dung dịch chiết được, (ml). - v: thể tích dung dịch đem xác định, (ml). - m: trọng lượng mẫu, (g).
h. Phương pháp xác định chỉ số DE của pectin thô
ü Nguyên tắc
Dựa vào sự thủy phân liên kết este trong phân tử pectin trong môi trường kiềm. Pectin khi bị tác dụng của chất kiềm loãng sẽ giải phóng nhóm metoxyl dưới dạng rượu metylic và axit pectic. Từ hàm lượng kiềm tiêu tốn trong phản ứng thủy phân có thể tính được chỉ số DE của pectin [1].
ü Cách tiến hành
Hòa tan 0,5g pectin thô với nước cất thành 100ml dung dịch pectin đồng nhất. Hút 10ml dung dịch pectin cho vào bình tam giác 250ml rồi cho thêm NaOH 0,1N, khuấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút. Sau đó dùng 30ml H2SO4 0,1N để trung hòa NaOH. Đem đi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein. Ghi lại thể tích NaOH chuẩn độ.
Trong đó,
- V1: thể tích dung dịch đem đi xác định, (ml). - V2: thể tích NaOH chuẩn độ, (ml).