1.3.2.1. Phát hiện đột biến EGFR trên DNA
a. Các phương pháp giải trình tự
Giải trình tự trực tiếp Sanger được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện đột biến từ những năm 1970 và vẫn còn phổ biến đến hiện nay. Phương pháp này thường sử dụng khuôn đầu vào là DNA được tách chiết từ mẫu mô của khối u thu nhận từ sinh thiết hoặc phẫu thuật, thường là các khối mô đúc nến phục vụ cho mục đích mô bệnh học [78, 82]. Tuy nhiên, do quy trình phức tạp, tốn thời gian, cần lượng mẫu nhiều cũng như độ nhạy thấp khi chỉ phát hiện được đột biến khi có đủ lượng DNA đột biến (>25% alen đột biến trong mẫu để đạt kết quả phân tích đột biến tối ưu) đã hạn chế sự phổ biến của giải trình tự Sanger trong ứng dụng lâm sàng [82].
Bên cạnh giải trình tự Sanger, giải trình tự thế hệ mới (NGS) được phát triển trong những năm gần đây là phương pháp thay thế giải trình tự Sanger do độ nhạy
18
cao hơn với khả năng phát hiện đột biến trong mẫu có nồng độ đột biến thấp [38]. Đây là phương pháp có khả năng giải trình tự hàng triệu đoạn DNA nhỏ song song và phát hiện tất cả ba loại biến đổi di truyền trong bệnh học lâm sàng (biến đổi đơn nucleotide, sự thay đổi số lượng bản sao và tái sắp xếp di truyền) trong nhiều gen ở trong cùng một lần chạy [29, 64]. Các nghiên cứu về sử dụng NGS trong phát hiện đột biến gen trong UTP cho thấy khả năng phát hiện được 10 ng DNA mẫu từ mẫu tế bào sinh thiết [83] và độ nhạy vượt trội hơn phương pháp giải trình tự Sanger với khả năng phát hiện đột biến với nồng độ 5% trong mẫu [15]. NGS được xem là phương pháp hiệu quả để phát hiện đột biến trong mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn muộn. So sánh với kết quả phát hiện đột biến trên mẫu mô, NGS có độ nhạy lâm sàng 93% (38/41), độ đặc hiệu lâm sàng 94% (60/64) khi phân tích đột biến EGFR T790M và độ nhạy lâm sàng 100% (17/17), độ đặc hiệu lâm sàng 100% (48/48) khi phân tích đột biến EGFR L858R [84]. Tuy vậy, hạn chế thương
gặp phải khi ứng dụng NGS vào thực tế xét nghiệm lâm sàng là sự tốn kém về thời gian và chi phí cũng như yêu cầu kĩ thuật viên có trình độ cao để thực hiện quy trình và phân tích kết quả.
b. Phương pháp khuếch đại đặc hiệu gen đích
Phương pháp giải trình tự giúp sàng lọc phát hiện được tất cả các loại đột biến tuy nhiên thường gặp các bất lợi như độ nhạy thấp, đòi hỏi phải làm giàu mẫu trước khi phân tích, có xu hướng cần nhiều kĩ thuật viên và thời gian xét nghiệm kéo dài… Do đó, các phương pháp phát hiện đột biến bằng khuếch đại gen đích được phát triển với tiềm năng giảm thời gian xét nghiệm và tăng độ nhạy. Các phương pháp phát hiện đột biến đích trên gen EGFR hầu hết đều dựa vào PCR, so sánh với giải trình tự
Sanger, là một phương pháp nhanh chóng để phát hiện các đột biến phổ biến với độ nhạy cao.
Phương pháp PCR đặc hiệu allele (ARMS – amplification refractory mutation system) là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân biệt DNA đột biến và DNA kiểu dại bằng cách khuếch đại có chọn lọc trình tự alen đích mang đột biến. ARMS sử dụng một mồi có khả năng phân biệt alen (mồi phân biệt alen). Mồi này có trình tự bổ sung hoàn toàn với một alen và không bổ sung hoàn toàn với alen còn lại. Thông thường, vị trí của nucleotide không bổ sung trên trình tự mồi này thường ở tận cùng đầu 3’ hoặc ở gần đầu 3’, nhằm ngăn không cho DNA polymerase kéo dài chuỗi
19
khi mồi bắt cặp vào các trình tự DNA đích bổ sung không hoàn toàn. Ngoài ra, vị trí của nucleotide không bổ sung đôi khi có thể nằm ở giữa trình tự mồi, nhằm ngăn chặn mồi phân biệt alen bắt cặp vào trình tự DNA không mong muốn [37]. Trong phương pháp này, người ta giả thiết rằng mồi phân biệt alen chỉ bắt cặp và kéo dài chuỗi khi trình tự mồi bổ sung hoàn toàn với trình tự đích. Nếu giả thiết này đúng thì chỉ có những phân tử DNA đích với trình tự hoàn toàn bổ sung với mồi phân biệt alen mới được khuếch đại trong phản ứng PCR đặc hiệu alen, còn những phân tử DNA có trình tự bổ sung không hoàn toàn sẽ không được khuếch đại. Nghiên cứu cho thấy ARMS có khả năng pháp hiện các đột biến đích gấp hai lần so với phương pháp giải trình tự trực tiếp [21] và khả năng phát hiện đột biến trong mẫu mô và mẫu máu với nồng độ đột biến trong mẫu từ 0,1%-1% [20]. Công bố của Kimura và cộng sự trên bệnh nhân UTPKTBN điều trị bằng gefitinib cho thấy ARMS có khả năng phát hiện các đột biến EGFR trên mẫu máu ngoại vi với độ nhạy 85,7% và độ đặc hiệu 94,3% khi so sánh kết quả phát hiện đột biến trên mẫu mô [51]. Một số bộ kit để xác định đột biến EGFR trên thị trường hiện nay như các bộ kit “Cobas ® EGFR mutation test” (Roche
Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA) và “Therascreen EGFR RGQ PCR Kit” (Qiagen, Hilden, Đức) được phát triển dựa trên phương pháp ARMS, thường được sử dụng trong các nghiên cứu liên quan đến phát hiện đột biến gen EGFR [18, 34, 46, 51].
Một số phương pháp mới hơn như BEAMing (beads, emulsion, amplification and magnetics) và ddPCR (digital droplet PCR) được phát triển với độ nhạy cao để xác định các đột biến với nồng độ thấp trong mẫu máu ngoại vi. Khi so sánh với kết quả phát hiện đột biến EGFR T790M trên mẫu máu ngoại vi so với trên mẫu mô sinh thiết của bệnh nhân UTPKTBN, BEAMing có độ nhạy lâm sàng 70% - 80% và độ đặc hiệu lâm sàng 60-70% [75, 108]. ddPCR là phương pháp có khả năng phát hiện đột biến với độ nhạy và độ chính xác cao, ở mức một phân tử EGFR đột biến trong 20.000 bản sao DNA kiểu dại trên mẫu mô, mẫu máu và mẫu nước tiểu [126]. Nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã báo cáo ddPCR có thể phát hiện đột biến EGFR với độ nhạy 0,1-5% tỉ lệ đột biến trong mẫu [127]. Do đó, có thể sử dụng ddPCR để phát hiện đột biến trong mẫu đúc nến cũng như trong mẫu máu ngoại vi chứa DNA nguồn gốc khối u tự do [130]. Khi so sánh với kết quả phát hiện đột biến trên mô, ddPCR phát hiện đột biến EGFR L858R trong mẫu máu ngoại vi với độ nhạy lâm sàng 74%
20
(23/31) và độ đặc hiệu lâm sàng là 100% (143/143). Trong khi đó, kết quả phát hiện đột biến EGFR T790M với độ nhạy lâm sàng là 77% (27/35), nhưng độ đặc hiệu lâm sàng thấp hơn (63%, 12/19) [89]. Các nghiên cứu này giải thích lý do độ đặc hiệu lâm sàng của kết quả phát hiện đột biến EGFR T790M thấp, trong khi không phát hiện thấy mẫu âm tính giả với các đột biến khác, nhiều khả năng là do sự không đồng nhất về hệ gen, hơn là xét nghiệm có độ đặc hiệu thấp. Theo đó, kết quả của đột biến gen
EGFR T790M ở mẫu mô sinh thiết không đại diện cho tất cả các vị trí di căn [89,
108]. Điều này có thể giải thích lý do một số bệnh nhân dương tính với đột biến EGFR T790M trên mẫu máu ngoại vi nhưng âm tính với đột biến EGFR T790M trên mẫu mô sinh thiết có đáp ứng tốt với thuốc đích TKI thế hệ thứ ba [75].
1.3.2.2. Phát hiện đột biến EGFR trên protein
Hóa mô miễn dịch là phản ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể giúp phát hiện đột biến của protein EGFR trên bề mặt khối u. Nghiên cứu của Yu và cộng sự [125] đã phát triển hai kháng thể đơn dòng đặc hiệu với hai đột biến EGFR thường gặp là đột biến mất đoạn E746-A750 ở exon 19 và đột biến L858R. Các kháng thể này giúp xác định protein EGFR đột biến với độ nhạy lâm sàng 92% và độ đặc hiệu lâm sàng 99% khi so sánh với giải trình tự trực tiếp. Nghiên cứu trên cũng cho thấy hóa mô miễn dịch sử dụng hai kháng thể đơn dòng để phát hiện protein EGFR đột biến là phương pháp đơn giản, nhanh và hiệu quả về mặt chi phí để sàng lọc các bệnh nhân UTP cho các liệu pháp điều trị phù hợp. Một số nghiên cứu khác sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện đột biến EGFR L858R ở bệnh nhân
UTPKTBN cho thấy độ đặc hiệu lâm sàng tương đối cao (77% - 100%) trong khi độ nhạy lâm sàng dao động lớn (24% - 100%) [41, 49, 50, 52, 56, 100, 120, 125]. Sự dao động lớn của độ nhạy lâm sàng trong điều kiện cùng sử dụng một loại kháng thể được quy cho ngưỡng sử dụng để đánh giá một kết quả hóa mô miễn dịch là dương tính hay âm tính vẫn còn mang tính chất chủ quan và chưa thống nhất rõ ràng [50]. Như vậy, hóa mô miễn dịch phát hiện protein EGFR đột biến có thể hỗ trợ các phương pháp xét nghiệm trên DNA trong điều kiện giới hạn tế bào khối u trong mẫu mô sinh thiết.
21
1.3.2.3. Phát hiện đột biến EGFR trên RNA
Như vậy, hầu hết các phương pháp phát hiện đột biến đã được mô tả hiện nay đều được thực hiện trên khuôn DNA và protein. Tuỳ thuộc vào cơ chế sử dụng và cách thức vận dụng cụ thể sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện đột biến. Trong khi đó, việc sử dụng phân tử RNA làm khuôn trong các xét nghiệm phân tích đột biến còn hạn chế mặc dù có thể mang lại nhiều ưu điểm đáng chú ý so với khuôn DNA.
Nghiên cứu của Tsai TH và cộng sự năm 2012 trên mẫu tràn dịch màng phổi ác tính của 150 bệnh nhân UTP điều trị thuốc TKI thế hệ thứ nhất cho kết quả phát hiện đột biến EGFR bằng giải trình tự trên RNA được cải thiện hơn nhiều so với giải trình tự và phân tích khối phổ trên DNA (tương ứng là 67,3% với 44,7% với 46,7% ở đột biến L858R) [106]. Ở bệnh nhân đang điều trị thuốc đích, giải trình tự gen
EGFR trên RNA cho kết quả thỏa đáng với tỉ lệ phát hiện đột biến EGFR T790M là
54,2% [106]. Như vậy, phát hiện đột biến EGFR mức độ RNA bằng phương pháp
giải trình tự đã cải thiện độ nhạy, qua đó chứng minh RNA là nguồn vật liệu tiềm năng để phân tích đột biến gen EGFR cho bệnh nhân UTPKTBN. Độ nhạy phân tích đột biến gen được cải thiện khi sử dụng khuôn RNA phù hợp với thực tế là do EGFR thường tăng biểu hiện trong các tế bào ung thư, dẫn tới phân tích đột biến sử dụng khuôn RNA có thể sẽ đạt được độ nhạy cao hơn. Hơn nữa, phương pháp phân tích đột biến sử dụng khuôn RNA không chỉ cho chúng ta biết sự xuất hiện của đột biến mà còn giúp xác định được mức độ biểu hiện gen của alen đột biến. Do đó, phương pháp này có khả năng phản ánh được các hệ quả chức năng của alen đột biến đối với tế bào và mô tổ chức một cách trung thực hơn so với các phương pháp phân tích đột biến sử dụng khuôn DNA [122].
Nghiên cứu của Hồ Hữu Thọ và cộng sự đã công bố phương pháp ExBP-RT đơn giản giúp phát hiện đột biến trên RNA với độ nhạy cao hơn từ 10-30 lần so với các phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay [40], mở ra triển vọng lớn trong các ứng dụng lâm sàng khác nhau. ExBP-RT phiên mã ngược các biến thể RNA khác nhau nhỏ (thay thế một nucleotide) trong phản ứng phiên mã ngược thành sản phẩm cDNA đặc hiệu alen để có thể phân biệt dễ dàng bằng phản ứng qPCR. Cụ thể, để phân tích đột biến điểm của một gen ở mRNA, mồi phiên mã ngược đặc hiệu đột biến (mồi đặc hiệu đột biến) được thiết kế bổ sung hoàn toàn với mRNA mang đột biến
22
để chọn lọc được đột biến. Mồi đặc hiệu đột biến gồm 2 phần: Đầu 3’ dài khoảng 10- 13 nucleotide bổ sung hoàn toàn với mRNA mang đột biến, đầu 5’ là phần đuôi dài 10-11 nucleotide với trình tự hoàn toàn không liên quan tới gen đích. Mồi đặc hiệu đột biến phiên mã ngược các mRNA mang đột biến thành các cDNA chứa phần đuôi của mồi đặc hiệu đột biến. Đồng thời, mẫu dò khoá có thể kéo dài (Extendable Blocking Probe – ExBP) được thiết kế dài khoảng 10-13 nucleotide, bổ sung hoàn toàn với mRNA kiểu dại của gen đó, có trình tự cạnh tranh với mồi đặc hiệu đột biến. Mẫu dò khóa có nhiệm vụ bắt cặp, kéo dài và khoá các mRNA kiểu dại.
Hình 7: Nguyên lý phương pháp ExBP-RT [110]
Phương pháp ExBP-RT gồm 2 bước: I) Phản ứng phiên mã ngược sử dụng một mồi phiên mã ngược đặc hiệu đột biến và một mẫu dò khóa cạnh tranh có thể kéo dài (ExBP); II) phản ứng qPCR khuếch đại chọn lọc: cDNA tổng hợp từ mồi đặc hiệu đột biến có chứa đuôi nucleotide không liên quan với gen đích, tạo điều kiện cho mồi ngược khuếch đại sản phẩm, còn cDNA tổng hợp từ mẫu dò khóa ExBP do không có phần đuôi nên mồi ngược không thể bắt cặp vào để khuếch đại sản phẩm.
Phản ứng phiên mã ngược chứa mồi đặc hiệu đột biến và mẫu dò khóa, được khởi đầu ở nhiệt độ khá cao (~50oC) so với trình tự mồi 10-13 nucleotide. Sau đó, phản ứng được hạ nhiệt độ dần về nhiệt độ từ 50oC 40oC để giảm thiểu sự bắt cặp nhầm của mồi mà vẫn đảm bảo hiệu suất phiên mã ngược (Hình 7.I). Bên cạnh được sử dụng làm mồi phiên mã ngược, mồi đặc hiệu đột biến được sử dụng làm mồi ngược trong phản ứng qPCR khuếch đại chọn lọc cDNA mang đột biến. Trong bước qPCR, phần đuôi 5’ của mồi đặc hiệu đột biến cho phép khuếch đại và phát hiện sản phẩm
23
cDNA đột biến. Các cDNA được phiên mã ngược từ mRNA kiểu dại do không có phần đuôi nên mồi ngược PCR không bắt cặp được ở nhiệt độ gắn mồi 60-63oC để khuếch đại [40, 110] (Hình 7.II). Như vậy, mRNA kiểu dại và mRNA đột biến được phân biệt với nhau ngay ở bước phiên mã ngược và ở bước tiếp theo (qPCR) chỉ các trình tự cDNA phiên mã ngược từ mRNA đột biến tiếp tục được khuếch đại đặc hiệu nhờ việc sử dụng mồi ngược đột biến.
Công bố đầu tiên về phương pháp ExBP-RT [40] đã mô tả cách sử dụng quy trình phiên mã ngược với bước hạ nhiệt dần (50oC 40oC) để tăng tính chọn lọc của mồi với khuôn đặc hiệu (10-13 nucleotide). Tuy nhiên để bước phiên mã ngược này không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ phòng, tác giả đã tiến hành ủ phản ứng ở 65oC trong 5 phút, hạ nhiệt độ về 50oC mới tiến hành bổ sung enzyme phiên mã ngược vào phản ứng. Thao tác bằng tay này khiến kết quả thí nghiệm bị ảnh hưởng bởi thiết bị và kỹ thuật viên thực hiện. Do đó, trong công bố tiếp theo [110], tác giả đã sử dụng một enzyme phiên mã ngược mới có khả năng ức chế phản ứng ở nhiệt độ phòng, để hạn chế thao tác và sai sót trong quá trình thực hiện. Như vậy, tiếp tục các nghiên cứu trên, nghiên cứu này tiến hành tối ưu quy trình ExBP-RT - qPCR thành quy trình one- step RT-qPCR để dễ dàng áp dụng quy trình vào thực tế.
Phương pháp ExBP-RT đã phân tích đột biến trên gen KRAS và BRAF và cho kết quả phát hiện đột biến với độ nhạy kĩ thuật cao, có thể phát hiện đột biến với nồng độ gen đột biến là 0,017%-0,09% [40] và 0,005% [110]. Với khả năng phát hiện các đột biến gen với nồng độ thấp, phương pháp này có tiềm năng hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị ngay cả khi chưa có biểu hiện lâm sàng, nhằm cải thiện tiên lượng các bệnh lý ung thư nói chung. Với ưu điểm có thể phát hiện đột biến trên RNA, từ đó có thể nâng cao độ nhạy phát hiện đột biến, cùng với thời gian thực hiện quy trình nhanh hơn so với giải trình tự RNA, phương pháp ExBP-RT có tiềm năng trong ứng dụng thực tế. Điều này cho thấy sự cần thiết phải tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp ExBP-RT phát hiện đột biến đột biến điểm EGFR để hỗ trợ chiến lược điều trị đích TKI ở bệnh nhân UTPKTBN. Tóm lại, khả năng phát hiện được đột biến