Để đánh giá khả năng phát hiện đột biến của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên mRNA ở nhóm mẫu bệnh phẩm trước điều trị, bộ kit thương mại therascreen EGFR RGQ PCR Kit, Version 2 (Qiagen, Đức) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đối chiếu kết quả về khả năng phát hiện đột biến trên RNA so với DNA. Kết quả phát hiện đột biến trên DNA bằng bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit được tính toán bằng giá trị ∆Ct giữa phản ứng đột biến và phả n
ứng EGFR tổng số của cùng một mẫu.
40
Trong đó, Ctđột biến là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR đột biến; CtDNA tổng số là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR tổng số. Giá trị
Ct được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q 2.3.1.49 (Qiagen, Đức).
Sau đó, so sánh với giá trị cut-off tương ứng của loại đột biến theo khuyến cáo của bộ kit để đưa ra kết quả. Giá trị cut-off này được định nghĩa là giá trị mà tại đó tín hiệu dương tính có thể phân biệt được với tín hiệu nhiễu gây ra bởi mồi ARMS trên khuôn DNA kiểu dại. Nếu giá trị ∆Ct của mẫu cao hơn giá trị cut-off, đưa ra kết luận không phát hiện đột biến trên khuôn DNA hoặc do giới hạn phát hiện của bộ kit. Ngược lại, nếu giá trị ∆Ct của đột biến nào đó của mẫu thấp hơn giá trị cut-off, kết luận mẫu dương tính với đột biến đó (Bảng 12).
Bảng 12: Giá trị cut-off của bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit phát hiện đột biến EGFR DNA
Phản ứng đột biến Giá trị cut-off
T790M 7,40
L858R 8,90
Sau khi so sánh hiệu quả phát hiện đột biến T790M/L858R trên khuôn RNA với khuôn DNA, hiệu quả phát hiện đột biến T790M mRNA trên nhóm mẫu đang điều trị đích được tiếp tục đánh giá.