Mô đúc nến sau khi thu thập được cắt thành các lắt cắt ngang với độ dày khoảng 10 μm và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Mẫu được lưu ở tủ 4oCđến khi tách chiết. Mẫu mô đúc nến được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Omega FFPE RNA/DNA Kit (Omega, USA) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Lượng mẫu đầu vào sử dụng khoảng 5-10 mg mẫu mô và thể tích RNA/DNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5-8 ml/lần được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. Trong vòng 2h sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm, tách huyết tương bằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết. Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi tách chiết. Mẫu huyết tương từ máu ngoại vi/dịch màng phổi được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Circulating Nucleic Acid
39
Kit (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thể tích huyết tương/dịch màng phổi được sử dụng để tách chiết là 2 mL và thể tích RNA/RNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
2.2.7. Phân tích đột biến trên mRNA bằng quy trình ExBP-RT đã tối ưu
Sau khi tối ưu thành công quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên RNA, tiến hành phân tích đột biến T790M/L858R trên các nhóm mẫu mRNA đã được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm. Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ thống máy realtime PCR Rotor Gene Q (Qiagen, Đức). Mỗi lượt chạy đều bao gồm đối chứng dương (PC) là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến, chứng âm (NC) là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo kiểu dại và chứng âm nước (NTC). Đối với mỗi mẫu, bên cạnh phản ứng phát hiện đột biến được thực hiện lặp lại 2 lần, một phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số đánh giá chất lượng mẫu cũng được thực hiện song song.
Phân tích mẫu mang/không mang đột biến được dựa vào giá ∆Ct. ∆Ct được tính bằng hiệu số Ct giữa phản ứng đặc hiệu đột biến và phản ứng tổng số, theo công thức:
∆Ct = Ctđột biến - CtRNA tổng số
Trong đó, Ctđột biến là giá trị Ct của phản ứng RT-qPCR khuếch đại RNA EGFR đột
biến; CtRNA tổng số là giá trị Ct của phản ứng RT-qPCR khuếch đại RNA EGFR tổng
số. Giá trị Ct được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q 2.3.1.49 (Qiagen, Đức).
2.2.8. Phân tích đột biến trên DNA bằng phương pháp ARMS
Để đánh giá khả năng phát hiện đột biến của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên mRNA ở nhóm mẫu bệnh phẩm trước điều trị, bộ kit thương mại therascreen EGFR RGQ PCR Kit, Version 2 (Qiagen, Đức) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đối chiếu kết quả về khả năng phát hiện đột biến trên RNA so với DNA. Kết quả phát hiện đột biến trên DNA bằng bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit được tính toán bằng giá trị ∆Ct giữa phản ứng đột biến và phả n
ứng EGFR tổng số của cùng một mẫu.
40
Trong đó, Ctđột biến là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR đột biến; CtDNA tổng số là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR tổng số. Giá trị
Ct được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q 2.3.1.49 (Qiagen, Đức).
Sau đó, so sánh với giá trị cut-off tương ứng của loại đột biến theo khuyến cáo của bộ kit để đưa ra kết quả. Giá trị cut-off này được định nghĩa là giá trị mà tại đó tín hiệu dương tính có thể phân biệt được với tín hiệu nhiễu gây ra bởi mồi ARMS trên khuôn DNA kiểu dại. Nếu giá trị ∆Ct của mẫu cao hơn giá trị cut-off, đưa ra kết luận không phát hiện đột biến trên khuôn DNA hoặc do giới hạn phát hiện của bộ kit. Ngược lại, nếu giá trị ∆Ct của đột biến nào đó của mẫu thấp hơn giá trị cut-off, kết luận mẫu dương tính với đột biến đó (Bảng 12).
Bảng 12: Giá trị cut-off của bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit phát hiện đột biến EGFR DNA
Phản ứng đột biến Giá trị cut-off
T790M 7,40
L858R 8,90
Sau khi so sánh hiệu quả phát hiện đột biến T790M/L858R trên khuôn RNA với khuôn DNA, hiệu quả phát hiện đột biến T790M mRNA trên nhóm mẫu đang điều trị đích được tiếp tục đánh giá.
2.2.9. Phân tích thống kê
Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các đặc điểm cận lâm sàng và kết quả phát hiện đột biến EGFR bằng kỹ thuật ExBP-RT dựa trên kiểm định Mann-Whitney U test hoặc Wilcoxon test. Hệ số Cohen’s Kappa được sử dụng để đánh giá về sự tương đồng kết quả phát hiện đột biến trên RNA so với kết quả phát hiện đột biến trên DNA. Phân tích thống kê được thực hiện với phần mềm SPSS 20 (IBM) và GraphPad Prism 9.0.2 (161). Giá trị p < 0,05 biểu thị mối sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Độ nhạy lâm sàng, độ đặc hiệu lâm sàng và độ chính xác lâm sàng của quy trình phát hiện đột biến được tính toán bằng phần mềm MedCalc Version 19.7.2. Độ nhạy lâm sàng được định nghĩa là khả năng xác định chính xác những bệnh nhân có bệnh của một xét nghiệm, được thể hiện qua tỷ lệ những trường hợp mắc bệnh có kết
41
quả xét nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh. Độ nhạy lâm sàng được xác định dựa trên công thức:
Độ 𝑛ℎạ𝑦 𝑙â𝑚 𝑠à𝑛𝑔 = 𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡
𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡 + Â𝑚 𝑡í𝑛ℎ 𝑔𝑖ả
Trong đó:
o Tổng số trường hợp dương tính thật được hiểu là tổng số xét nghiệm cho kết quả dương tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên DNA (Qiagen) cũng cho kết quả dương tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên mRNA (ExBP-RT).
o Tổng số trường hợp (dương tính thật và âm tính giả) được hiểu là tổng số trường hợp có kết quả dương tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên DNA (Qiagen).
Độ đặc hiệu lâm sàng được định nghĩa là khả năng xác định chính xác những bệnh nhân không có bệnh của một xét nghiệm, thể hiện qua tỷ lệ những trường hợp không bị bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp không bị bệnh. Độ đặc hiệu lâm sàng được xác định dựa trên công thức:
Độ đặ𝑐 ℎ𝑖ệ𝑢 𝑙â𝑚 𝑠à𝑛𝑔 = Â𝑚 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡
Â𝑚 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡 + 𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑔𝑖ả
Trong đó:
o Tổng số trường hợp âm tính thật được hiểu là tổng số xét nghiệm cho kết quả âm tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên DNA (Qiagen) cũng cho kết quả âm tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên mRNA (ExBP-RT).
o Tổng số trường hợp (Âm tính thật và dương tính giả) được là tổng số trường hợp có kết quả âm tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên DNA (Qiagen).
Độ chính xác lâm sàng được định nghĩa là khả năng tổng thể mà một bệnh nhân được xác định chính xác kết quả xét nghiệm. Độ chính xác lâm sàng được xác định dựa trên công thức:
42
Độ 𝑐ℎí𝑛ℎ 𝑥á𝑐 𝑙â𝑚 𝑠à𝑛𝑔 = (𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡 + Â𝑚 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡) 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢
43
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Để tối ưu và đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình phát hiện đột biến T790M và L858R trên mRNA, nghiên cứu sử dụng các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo của EGFR L858R, EGFR T790M và EGFR kiểu dại. Các RNA tổng hợp nhân tạo này được phiên mã từ các plasmid pBlueScript II KS(+) mang đoạn gen đích tương ứng. Sau khi tổng hợp, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá độ tinh sạch, kích thước và nồng độ để đưa vào sử dụng làm khuôn cho các phản ứng tối ưu và đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình cũng như là chứng dương (PC), chứng âm không mang đột biến (NC) trong phân tích đột biến trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
3.1.1. Đánh giá độ tinh sạch và nồng độ mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Tổng hợp RNA nhân tạo trong ống nghiệm là một quy trình đơn giản, cho phép tổng hợp trực tiếp các phân tử RNA từ DNA với năng suất cao. Sau khi được phiên mã từ các plasmid, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo dùng trong nghiên cứu này được đánh giá độ tinh sạch và nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 13.
Bảng 13: Kết quả đánh giá độ tinh sạch và nồng độ các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Mẫu chuẩn RNA tổng
hợp nhân tạo A260/A280 Nồng độ (ng/µl)
Nồng độ (bản sao/μl)
EGFR T790M 1,98 287,86 1,77x1012
EGFR L858R 2,02 273,20 1,67x1012
EGFR Kiểu dại 2,07 210,40 5,39x1011
Kết quả đo quang phổ cho thấy các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo đều nằm trong giới hạn 1,8 – 2,2, đảm bảo được độ tinh sạch cho mục đích sử dụng trong các bước tiếp theo.
3.1.2. Đánh giá kích thước mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Kích thước của RNA tổng hợp nhân tạo được tính từ điểm khởi đầu phiên mã của vùng T7 promoter đến trình tự đích chèn vào vector đến trình tự nhận biết enzyme
44
cắt XhoI. Theo tính toán lý thuyết kích thước mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo thu được sẽ dài hơn 103 nucleotide so với kích thước của DNA đích chèn vào vector. Như vậy, chiều dài của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M và EGFR L858R là 304 nucleotide, chiều dài của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại là 731 nucleotide. Kết quả điện di của các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được thể hiện ở hình 11.
Kết quả điện di đã chỉ ra các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo thu được đều chỉ có 1 band duy nhất với kích thước tương ứng với tính toán lý thuyết. Như vậy, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo tổng hợp được với kích thước mong muốn 304 nucleotide với RNA EGFR T790M, 304 nucleotide với RNA EGFR L858R và 731 nucleotide với RNA EGFR kiểu dại (Hình 11).
Hình 11: Kết quả điện di mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M,
EGFR L858R và EGFR kiểu dại
Từ kết quả điện di và đo quang phổ, số lượng bản sao thu được của các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được tính toán bằng công cụ NEBioCalculator
(https://nebiocalculator.neb.com/#!/ssrnaamt). Nồng độ mẫu chuẩn RNA tổng hợp
nhân tạo tương ứng của EGFR T790M, EGFR L858R và EGFR kiểu dại lần lượt là 1,77x1012; 1,67x1012; 5,39x1011 bản sao/μl (Bảng 11). Dựa vào nồng độ RNA tổng hợp nhân tạo tính toán trên, tiếp tục tiến hành pha loãng về nồng độ 105 bản sao/μl để
45
kiểm tra các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo trong điều kiện có/không bổ sung enzyme phiên mã ngược vào phản ứng.
3.1.3. Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số 3.1.3.1. Đánh giá RNA EGFR T790M và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi 3.1.3.1. Đánh giá RNA EGFR T790M và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi
khuếch đại RNA EGFR tổng số
Để kiểm tra sự có mặt của DNA plasmid dư thừa trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo và giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M,
EGFR kiểu dại nồng độ 105 bản sao/μl, phản ứng RT-qPCR được tiến hành với điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược bằng cặp mồi tổng số T790M_Fw/T790M_RvT và đầu dò T790M_P và khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M/EGFR kiểu dại. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 14 và phụ lục 1.
Bảng 14: Giá trị Ct của phản ứng đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số T790M_Fw/T790M_RvT và đầu dò T790M_P
RNA Có bổ sung RTase (RTase+) Không bổ sung RTase (RTase-) ∆Ct (CtRTase--CtRTase+) 2∆Ct EGFR T790M 22,95 37,16 14,21 1,90 x 104
EGFR kiểu dại 22,51 37,00 14,49 2,30 x 104
NTC NA NA
Trong trường hợp có bổ sung enzyme phiên mã ngược, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo có tín hiệu khuếch đại sớm khoảng 10.000 lần so với trường hợp không bổ sung enzyme phiên mã ngược (∆Ct >14) (Bảng 12). Tín hiệu của phản ứng RT-qPCR trong trường hợp không bổ sung enzyme phiên mã ngược có thể là tín hiệu của DNA plasmid còn dư thừa, không loại bỏ hết được sau quá trình tinh sạch. Ngoài ra, còn một giả thiết khác nữa là do hoạt động phiên mã ngược yếu của enzyme Taq DNA polymerase đã tạo nên tín hiệu khuếch đại kém này [107]. Tuy nhiên, trong cả hai trường hợp, với lượng DNA nhỏ hơn rất nhiều so với lượng RNA đã tổng hợp được không gây ảnh hưởng đến quá trình sử dụng mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo làm khuôn cho phản ứng phân biệt đột biến trên EGFR T790M và EGFR kiểu dại.
46
Đánh giá RNA tổng hợp nhân tạo 105 bản sao/μl bằng cặp mồi tổng số EGFR T790M cho giá trị Ct khoảng 23.
3.1.3.2. Đánh giá RNA EGFR L858R và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi
khuếch đại RNA EGFR tổng số
Để kiểm tra sự có mặt của DNA plasmid dư thừa trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo và giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R, EGFR kiểu dại nồng độ 105 bản sao/μl, phản ứng RT-qPCR được tiến hành với điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược bằng cặp mồi tổng số L858R_Fw/L858R_RvT và đầu dò L858R_P với khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R và EGFR kiểu dại. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 15 và phụ lục 1.
Bảng 15: Giá trị Ct của phản ứng đánh giá RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số L858R_Fw/L858R_RvT và đầu dò L858R_P RNA Có bổ sung RTase (RTase+) Không bổ sung RTase (RTase-) ∆Ct (CtRTase--CtRTase+) 2∆Ct EGFR L858R 22,78 35,07 12,29 0,51 x 104
EGFR kiểu dại 23,05 36,77 13,72 1,35 x 104
NTC NA NA
Kết quả đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi tổng số EGFR L858R cho kết quả tương tự với các RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá bằng cặp mồi tổng số EGFR T790M.
Như vậy, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được tổng hợp đúng với kích thước tính toán, sạch và nồng độ đủ làm khuôn để thiết lập và đánh giá quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến điểm EGFR T790M và EGFR L858R trên mRNA.
3.2. Tối ưu quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến điểm EGFR trên RNA 3.2.1. Tối ưu quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên RNA 3.2.1. Tối ưu quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên RNA
Quy trình ExBP-RT one-step phát hiện đột biến EGFR T790M được thiết lập bằng cách tiến hành tối ưu điều kiện về nồng độ mẫu dò khóa, nồng độ mồi đặc hiệu và các chất phụ gia.
47
3.2.1.1. Tối ưu nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP
Để lựa chọn nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP có khả năng khóa tốt các RNA của EGFR kiểu dại trong quy trình phát hiện đột biến T790M, nghiên cứu sử dụng khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo của EGFR kiểu dại nồng độ ~106 bản sao/μl. Các nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP được đánh giá là 4 μM, 2 μM, 0,5 μM, 0,2 μM. Chất lượng của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá bằng cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số là T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P (Hình 12).
Hình 12: Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP.
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR kiểu dại 106
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mẫu dò khóa 4 μM, 2 μM, 0,5 μM và 0,2 μM được chú thích màu như trong hình. Chứng âm NTC (đường màu đen) không có tín hiệu khuếch đại.
Tiêu chí lựa chọn là nồng độ mẫu dò khóa có khả năng khóa tốt nhất, tức là giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA EGFR kiểu dại tổng hợp nhân tạo cao nhất. Kết quả