Kích thước của RNA tổng hợp nhân tạo được tính từ điểm khởi đầu phiên mã của vùng T7 promoter đến trình tự đích chèn vào vector đến trình tự nhận biết enzyme
44
cắt XhoI. Theo tính toán lý thuyết kích thước mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo thu được sẽ dài hơn 103 nucleotide so với kích thước của DNA đích chèn vào vector. Như vậy, chiều dài của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M và EGFR L858R là 304 nucleotide, chiều dài của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại là 731 nucleotide. Kết quả điện di của các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được thể hiện ở hình 11.
Kết quả điện di đã chỉ ra các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo thu được đều chỉ có 1 band duy nhất với kích thước tương ứng với tính toán lý thuyết. Như vậy, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo tổng hợp được với kích thước mong muốn 304 nucleotide với RNA EGFR T790M, 304 nucleotide với RNA EGFR L858R và 731 nucleotide với RNA EGFR kiểu dại (Hình 11).
Hình 11: Kết quả điện di mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M,
EGFR L858R và EGFR kiểu dại
Từ kết quả điện di và đo quang phổ, số lượng bản sao thu được của các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được tính toán bằng công cụ NEBioCalculator
(https://nebiocalculator.neb.com/#!/ssrnaamt). Nồng độ mẫu chuẩn RNA tổng hợp
nhân tạo tương ứng của EGFR T790M, EGFR L858R và EGFR kiểu dại lần lượt là 1,77x1012; 1,67x1012; 5,39x1011 bản sao/μl (Bảng 11). Dựa vào nồng độ RNA tổng hợp nhân tạo tính toán trên, tiếp tục tiến hành pha loãng về nồng độ 105 bản sao/μl để
45
kiểm tra các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo trong điều kiện có/không bổ sung enzyme phiên mã ngược vào phản ứng.