đột biến T790M và L858R trên mRNA
Thiết kế mồi là một bước quan trọng trong thiết lập quy trình PCR. Về mặt lí thuyết, các tiêu chí lựa chọn cặp mồi khá đơn giản nhưng cũng rất nghiêm ngặt để đảm bảo khuếch đại được đoạn DNA mong muốn. Thứ nhất, trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc. Thứ hai, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa. Không nên quá nhiều GC nối tiếp nhau, tỉ lệ GC trong khoảng 30% -70%. Thứ 3, không nên nhiều bắt cặp sai giữa mồi với DNA khuôn, các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp trên DNA. Thứ 4, trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (< 3000 bp với PCR thông thường và < 200 bp với realtime PCR). Ngoài các yếu tố cơ bản trên, một mồi được thiết kế tốt còn liên quan đến một số yếu tố khác được tính toán dựa trên phần mềm thiết kế mồi như năng lượng tự do đầu 3’,5’...
Trình tự mồi, mẫu dò khóa và đầu dò Taqman được thiết kế bằng phần mềm Primer Express Software (Perkin-Elmer Corp., Foser city, CA). Trình tự của gen
EGFR được lấy từ cơ sở dữ liệu trình tự của GenBank (NM_001346897.1). Thiết kế
mồi, mẫu dò khóa và đầu dò Taqman cho quy trình phát hiện đột biến điểm T790M và L858R cần đảm bảo các thông số như thiết kế mồi cho PCR. Bên cạnh đó, nhiệt độ gắn mồi trong bước phiên mã ngược được ước lượng nhờ sử dụng các thông số nhiệt động học của DNA. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi thực tế của các mồi và mẫu dò khoá khi gắn vào khuôn mRNA đích để tạo thành phức hợp lai DNA-mRNA thường sẽ cao hơn giá trị tính toán trên phần mềm một vài oC.
31
Hình 10: Minh họa vị trí gắn mồi của phản ứng tổng số và phản ứng đặc hiệu đột biến để phát hiện đột biến T790M mRNA và L858R trên RNA
Trình tự được khuếch đại nhờ phản ứng qPCR đều có độ dài < 100 bp. Tín hiệu khuếch đại trình tự có đột biến tương ứng với tín hiệu huỳnh quang do đầu dò Taqman probe phát ra trong phản ứng phân biệt đột biến và được ghi nhận bằng hệ thống real-time Rotor-Gen Q. Các mồi/mẫu dò được sử dụng trong RT-qPCR để phát hiện đột biến T790M hoặc L858R trên RNA được liệt kê trong hình 10 và bảng 3.
Bảng 3: Danh mục mồi/đầu dò được sử dụng trong RT-qPCR
Tên mồi/đầu
dò Trình tự (3’ → 5’) Mục đích sử dụng
Quy trình phát hiện đột biến T790M
T790M_Fw CCAGCGTGGACAACCCCCAC Mồi xuôi của phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR T790M
T790M_P GTGCCGCCTGCTGGGCAT Đầu dò trong phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR T790M
T790M_RvT GCACGGTGGAGGTGAGGCAG
Mồi phiên mã ngược RNA EGFR tổng số và mồi ngược trong phản ứng khuếch đại
cDNA EGFR tổng số
T790M_RvS TTCTTGTGAGGCTGCATGATGA
Mồi phiên mã ngược của RNA EGFR T790M và là mồi ngược trong phản ứng
32
T790M_ExBP GCTGCGTGATGA Mồi khóa RNA EGFR kiểu dại trong phản ứng phiên mã ngược
Quy trình phát hiện đột biến L858R
L858R_Fw AGCCAGGAACGTACTGGTGA Mồi xuôi của phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR L858R
L858R_P ACACCGCAGCATGTCAAGAT Đầu dò trong phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR L858R
L858R_RvT GCCAGCCCAAAATCTGTG
Mồi phiên mã ngược RNA EGFR tổng số và mồi ngược trong phản ứng khuếch đại
cDNA EGFR tổng số
L858R_RvS TTAGTATCCGAGGCCCGCCCA
Mồi phiên mã ngược của RNA EGFR L858R và là mồi ngược trong phản ứng
khuếch đại cDNA EGFR L858R.
L858R_ExBP TGGCCAGCCCAA Mồi khóa RNA EGFR kiểu dại trong phản ứng phiên mã ngược