3.1.3.1. Đánh giá RNA EGFR T790M và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi
khuếch đại RNA EGFR tổng số
Để kiểm tra sự có mặt của DNA plasmid dư thừa trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo và giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M,
EGFR kiểu dại nồng độ 105 bản sao/μl, phản ứng RT-qPCR được tiến hành với điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược bằng cặp mồi tổng số T790M_Fw/T790M_RvT và đầu dò T790M_P và khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR T790M/EGFR kiểu dại. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 14 và phụ lục 1.
Bảng 14: Giá trị Ct của phản ứng đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số T790M_Fw/T790M_RvT và đầu dò T790M_P
RNA Có bổ sung RTase (RTase+) Không bổ sung RTase (RTase-) ∆Ct (CtRTase--CtRTase+) 2∆Ct EGFR T790M 22,95 37,16 14,21 1,90 x 104
EGFR kiểu dại 22,51 37,00 14,49 2,30 x 104
NTC NA NA
Trong trường hợp có bổ sung enzyme phiên mã ngược, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo có tín hiệu khuếch đại sớm khoảng 10.000 lần so với trường hợp không bổ sung enzyme phiên mã ngược (∆Ct >14) (Bảng 12). Tín hiệu của phản ứng RT-qPCR trong trường hợp không bổ sung enzyme phiên mã ngược có thể là tín hiệu của DNA plasmid còn dư thừa, không loại bỏ hết được sau quá trình tinh sạch. Ngoài ra, còn một giả thiết khác nữa là do hoạt động phiên mã ngược yếu của enzyme Taq DNA polymerase đã tạo nên tín hiệu khuếch đại kém này [107]. Tuy nhiên, trong cả hai trường hợp, với lượng DNA nhỏ hơn rất nhiều so với lượng RNA đã tổng hợp được không gây ảnh hưởng đến quá trình sử dụng mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo làm khuôn cho phản ứng phân biệt đột biến trên EGFR T790M và EGFR kiểu dại.
46
Đánh giá RNA tổng hợp nhân tạo 105 bản sao/μl bằng cặp mồi tổng số EGFR T790M cho giá trị Ct khoảng 23.
3.1.3.2. Đánh giá RNA EGFR L858R và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi
khuếch đại RNA EGFR tổng số
Để kiểm tra sự có mặt của DNA plasmid dư thừa trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo và giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R, EGFR kiểu dại nồng độ 105 bản sao/μl, phản ứng RT-qPCR được tiến hành với điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược bằng cặp mồi tổng số L858R_Fw/L858R_RvT và đầu dò L858R_P với khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R và EGFR kiểu dại. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 15 và phụ lục 1.
Bảng 15: Giá trị Ct của phản ứng đánh giá RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số L858R_Fw/L858R_RvT và đầu dò L858R_P RNA Có bổ sung RTase (RTase+) Không bổ sung RTase (RTase-) ∆Ct (CtRTase--CtRTase+) 2∆Ct EGFR L858R 22,78 35,07 12,29 0,51 x 104
EGFR kiểu dại 23,05 36,77 13,72 1,35 x 104
NTC NA NA
Kết quả đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR L858R và EGFR kiểu dại bằng cặp mồi tổng số EGFR L858R cho kết quả tương tự với các RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá bằng cặp mồi tổng số EGFR T790M.
Như vậy, các mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được tổng hợp đúng với kích thước tính toán, sạch và nồng độ đủ làm khuôn để thiết lập và đánh giá quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến điểm EGFR T790M và EGFR L858R trên mRNA.