2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Để nghiên cứu phát triển và ứng dụng phương pháp phiên mã ngược đặc hiệu alen ExBP-RT phát hiện đột biến T790M hoặc L858R trên RNA với độ nhạy cao, nghiên cứu tiến hành theo các bước như sơ đồ nghiên cứu được trình bày ở hình 9.
30
Hình 9: Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Thiết kế mồi, mẫu dò khoá và đầu dò cho quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M và L858R trên mRNA đột biến T790M và L858R trên mRNA
Thiết kế mồi là một bước quan trọng trong thiết lập quy trình PCR. Về mặt lí thuyết, các tiêu chí lựa chọn cặp mồi khá đơn giản nhưng cũng rất nghiêm ngặt để đảm bảo khuếch đại được đoạn DNA mong muốn. Thứ nhất, trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc. Thứ hai, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa. Không nên quá nhiều GC nối tiếp nhau, tỉ lệ GC trong khoảng 30% -70%. Thứ 3, không nên nhiều bắt cặp sai giữa mồi với DNA khuôn, các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp trên DNA. Thứ 4, trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (< 3000 bp với PCR thông thường và < 200 bp với realtime PCR). Ngoài các yếu tố cơ bản trên, một mồi được thiết kế tốt còn liên quan đến một số yếu tố khác được tính toán dựa trên phần mềm thiết kế mồi như năng lượng tự do đầu 3’,5’...
Trình tự mồi, mẫu dò khóa và đầu dò Taqman được thiết kế bằng phần mềm Primer Express Software (Perkin-Elmer Corp., Foser city, CA). Trình tự của gen
EGFR được lấy từ cơ sở dữ liệu trình tự của GenBank (NM_001346897.1). Thiết kế
mồi, mẫu dò khóa và đầu dò Taqman cho quy trình phát hiện đột biến điểm T790M và L858R cần đảm bảo các thông số như thiết kế mồi cho PCR. Bên cạnh đó, nhiệt độ gắn mồi trong bước phiên mã ngược được ước lượng nhờ sử dụng các thông số nhiệt động học của DNA. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi thực tế của các mồi và mẫu dò khoá khi gắn vào khuôn mRNA đích để tạo thành phức hợp lai DNA-mRNA thường sẽ cao hơn giá trị tính toán trên phần mềm một vài oC.
31
Hình 10: Minh họa vị trí gắn mồi của phản ứng tổng số và phản ứng đặc hiệu đột biến để phát hiện đột biến T790M mRNA và L858R trên RNA
Trình tự được khuếch đại nhờ phản ứng qPCR đều có độ dài < 100 bp. Tín hiệu khuếch đại trình tự có đột biến tương ứng với tín hiệu huỳnh quang do đầu dò Taqman probe phát ra trong phản ứng phân biệt đột biến và được ghi nhận bằng hệ thống real-time Rotor-Gen Q. Các mồi/mẫu dò được sử dụng trong RT-qPCR để phát hiện đột biến T790M hoặc L858R trên RNA được liệt kê trong hình 10 và bảng 3.
Bảng 3: Danh mục mồi/đầu dò được sử dụng trong RT-qPCR
Tên mồi/đầu
dò Trình tự (3’ → 5’) Mục đích sử dụng
Quy trình phát hiện đột biến T790M
T790M_Fw CCAGCGTGGACAACCCCCAC Mồi xuôi của phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR T790M
T790M_P GTGCCGCCTGCTGGGCAT Đầu dò trong phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR T790M
T790M_RvT GCACGGTGGAGGTGAGGCAG
Mồi phiên mã ngược RNA EGFR tổng số và mồi ngược trong phản ứng khuếch đại
cDNA EGFR tổng số
T790M_RvS TTCTTGTGAGGCTGCATGATGA
Mồi phiên mã ngược của RNA EGFR T790M và là mồi ngược trong phản ứng
32
T790M_ExBP GCTGCGTGATGA Mồi khóa RNA EGFR kiểu dại trong phản ứng phiên mã ngược
Quy trình phát hiện đột biến L858R
L858R_Fw AGCCAGGAACGTACTGGTGA Mồi xuôi của phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR L858R
L858R_P ACACCGCAGCATGTCAAGAT Đầu dò trong phản ứng khuếch đại cDNA
EGFR tổng số và cDNA EGFR L858R
L858R_RvT GCCAGCCCAAAATCTGTG
Mồi phiên mã ngược RNA EGFR tổng số và mồi ngược trong phản ứng khuếch đại
cDNA EGFR tổng số
L858R_RvS TTAGTATCCGAGGCCCGCCCA
Mồi phiên mã ngược của RNA EGFR L858R và là mồi ngược trong phản ứng
khuếch đại cDNA EGFR L858R.
L858R_ExBP TGGCCAGCCCAA Mồi khóa RNA EGFR kiểu dại trong phản ứng phiên mã ngược
2.2.3. Tạo mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Phiên mã là quá trình tổng hợp RNA từ mạch khuôn DNA, được xúc tác bởi enzyme DNA-dependent RNA polymerase và thực hiện theo nguyên tắc bổ sung. Phiên mã tổng hợp nhân tạo là một quá trình đơn giản cho phép tổng hợp lượng lớn phân tử RNA trực tiếp từ bất kì trình tự oligonucleotide với chiều dài vài chục base đến vài kilobase.
2.2.3.1. Tạo mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Plasmid sau khi đặt hàng và nhận từ nhà sản xuất (GenScript Biotech, USA) ở dạng đông khô được pha về nồng độ 100 ng/μl.
Bước 1: Sử dụng enzyme cắt giới hạn XhoI (R0146S, NEB, Mỹ) để cắt plasmid từ dạng vòng thành dạng thẳng
Để tạo được các bản sao RNA có chiều dài xác định, plasmid DNA phải được cắt hoàn toàn thành dạng thẳng bằng enzyme cắt giới hạn nằm sau gen đích. Ngược lại, nếu sử dụng plasmid dạng vòng sẽ tạo ra các bản sao RNA có chiều dài khác nhau
33
do hiệu năng cao của T7 RNA Polymerase. Trong nghiên cứu này, XhoI được lựa
chọn bởi chỉ có duy nhất 1 vị trí nhận biết enzyme cắt XhoI trong plasmid khuôn và vị trí này nằm sau đoạn gen đích chèn vào vector.
Phản ứng cắt với enzyme XhoI (R0146S, NEB, Mỹ) được thực theo hướng dẫn của nhà sản xuất, với tổng thể tích phản ứng là 50 μl. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 60 phút trên máy PCR.
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộ kit Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (T1030S, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Kết quả thu được 20 µl sản phẩm plasmid dạng thẳng đã được tinh sạch để làm khuôn cho quá trình phiên mã.
Bước 3: Tổng hợp mẫu chuẩn RNA bằng bộ HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis (E2050, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 4 giờ trên máy PCR
Bước 4: Xử lý với DNase để loại bỏ khuôn DNA ở 37oC trong 15 phút.
Bước 5: Tinh sạch RNA tổng hợp nhân tạo với Monarch® RNA Cleanup Kit (T2050L, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3.2. Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Bước 1: Đánh giá độ tinh sạch và nồng độ của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp quang phổ:
Độ tinh sạch và nồng độ mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được xác định bằng cách đo phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng máy đo quang phổ nanodrop (ND1000, Thermo Scientific).
Số lượng bản sao của RNA tổng hợp nhân tạo được tính bằng phần mềm online Nebiocalculator (https://nebiocalculator.neb.com/#!/ssrnaamt)
Bước 2: Đánh giá kích thước sản phẩm bằng phương pháp điện di
Mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được điện di thường để kiểm tra kích thước trên gel agarose 2% và Low Range ssRNA Ladder (N0364S, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các RNA được biến tính ở 70oC/10 phút ở máy PCR
34
thường và được làm lạnh ngay ở trên khay đá lạnh. Điện di được thực hiện ở 70V trong 80 phút.
Bước 3: Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số
Pha loãng mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo xuống nồng độ 105 bản sao/μl dựa vào kết quả đo bằng nanodrop và kiểm tra bằng phương pháp RT-qPCR với cặp mồi khuếch đại RNA tổng số. Để đánh giá và đưa ra kết luận về quá trình RNA tổng hợp được tốt và không lẫn DNA trong RNA thu được, sử dụng phương pháp tiến hành đối chiếu kết quả giữa điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược trong thành phần phản ứng.
Với cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số của EGFR kiểu dại và T790M là T790M_Fw/ T790M_RvT/ T790M_P (Hình 10): Thực hiện phản ứng với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến T790M 105 bản sao/μl, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại 105 bản sao/μl và chứng âm NTC. Phản ứng one- step RT-qPCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl với thành phần phản ứng như bảng 4 và chu trình nhiệt như bảng 6. Phản ứng đánh giá DNA lẫn trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo T790M và EGFR kiểu dại sau phiên mã được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl với thành phần phản ứng như bảng 5 và chu trình nhiệt bảng 6.
Bảng 4: Thành phần phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số bằng cặp mồi T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm RT-qPCR HPNE 5X 1X 4 2 DMSO 100% 2,5% 0,5 3 Mồi xuôi T790M_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 4 Mồi ngược T790M_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 5 Đầu dò T790M_P 10 μM 0,2 μM 0,4 6 Nước xử lý DEPC 9,9 7 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
35
Bảng 5: Thành phần phản ứng khuếch đại DNA EGFR tổng số bằng cặp mồi T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm qPCR HPN 5X 1X 4 2 DMSO 100% 2,5% 0,5 3 Mồi xuôi T790M_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 4 Mồi ngược T790M_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 5 Đầu dò T790M_P 10 μM 0,2 μM 0,4 6 Nước xử lý DEPC 9,9 7 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
Bảng 6: Chu trình nhiệt one-step RT-qPCR
Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị
Phiên mã ngược Ủ 50 10 phút
Hạ nhiệt 50 40 1 độ/1 phút
Bất hoạt RTx + Biến tính + hoạt hóa Taq 95 15 phút
Khuếch đại Biến tính 94 15 giây
Chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 giây
Kéo dài (Green) 72 30 giây
Với cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số của EGFR kiểu dại và L858R là L858R_Fw/L858R_RvT/ L858R_P (Hình 10): Thực hiện phản ứng với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến L858R 105 bản sao/μl, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại 105 bản sao/μl và chứng âm NTC. Phản ứng one-step RT-qPCR được thực hiện với tổng thể tích 20 μl và thành phần phản ứng như bảng 7, chu trình nhiệt như bảng 6. Phản ứng đánh giá DNA lẫn trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo L858R và EGFR kiểu dại sau phiên mã được thực hiện với tổng
36
Bảng 7: Thành phần phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số bằng cặp mồi L858R_Fw/L858R_RvT/L858R_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4 2 Mồi xuôi L858R_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược L858R_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 4 Đầu dò L858R_P 10 μM 0,2 μM 0,4 5 Nước xử lý DEPC 10,4 6 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
Bảng 8: Thành phần phản ứng khuếch đại DNA EGFR tổng số bằng cặp mồi L858R_Fw/L858R_RvT/L858R_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm qPCR HPN 5X 1X 4 2 Mồi xuôi L858R_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược L858R_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 4 Đầu dò L858R_P 10 μM 0,2 μM 0,4 5 Nước xử lý DEPC 10,4 6 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
2.2.4. Tối ưu quy trình phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA
Với quy trình two-step được trình bày ở nghiên cứu trước [110], nghiên cứu tiến hành gộp thành phần và chu trình của quy trình two-step thành quy trình one- step như bảng 9 và bảng 6:
37
Bảng 9: Thành phần phản ứng ban đầu của quy trình one-step
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl/phản ứng)
1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4
2 Mồi xuôi Fw_10 μM 0,2 μM 0,4
3 Mồi ngược đặc hiệu đột biến_10 μM 0,4 μM 0,8
4 Mẫu dò khóa_50 μM 4 μM 1,6
5 Đầu dò_10 μM 0,2 μM 0,4
6 Khuôn RNA 4
7 Nước xử lý DEPC 8,8
Tổng thể tích 20
Sau khi đánh giá kết quả phát hiện đột biến bằng quy trình one-step trên khuôn RNA tổng hợp nhân tạo, tiếp tục tối ưu quy trình với các chất phụ gia (bao gồm Glycerol, BSA, DTT, DMSO), nồng độ mồi và điều kiện phản ứng khác.
2.2.5. Đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA
Để đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA, sử dụng mẫu chuẩn RNA mang đột biến tương ứng trộn với RNA EGFR kiểu dại theo các tỉ lệ khác nhau. RNA EGFR kiểu dại 106 bản sao/μl được trộn với các nồng độ khác nhau của RNA EGFR đột biến (106 đến 101 bản sao/μl). Kết quả tạo thành dải các tỉ lệ khác nhau giữa RNA EGFR đột biến : RNA EGFR kiểu dại, từ 10-1 đến 10-5 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) cho đột biến T790M (Bảng 10) và từ 1 đến 10-5 (1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) cho đột biến L858R (Bảng 11).
Bảng 10: Dải tỉ lệ trộn của RNA T790M : RNA EGFR kiểu dại
Nồng độ RNA
T790M (bản sao/μl)
Nồng độ RNA EGFR
kiểu dại (bản sao/μl)
Tỉ lệ thể tích được trộn
RNAT790M : RNA
EGFR kiểu dại
105 106 1:1 10-1
104 106 1:1 10-2
103 106 1:1 10-3
102 106 1:1 10-4
38
Bảng 11: Dải tỉ lệ trộn của RNA L858R : RNA EGFR kiểu dại
Nồng độ RNA
L858R (bản sao/μl)
Nồng độ RNA EGFR
kiểu dại (bản sao/μl)
Tỉ lệ thể tích được trộn
RNAL858R : RNA
EGFR kiểu dại
106 106 1:1 1 105 106 1:1 10-1 104 106 1:1 10-2 103 106 1:1 10-3 102 106 1:1 10-4 101 106 1:1 10-5
Độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện từng loại đột biến EGFR được xác định bằng khả năng phát hiện được RNA EGFR đột biến trong nền của 106 bản sao/μl RNA EGFR kiểu dại. Tức là, độ nhạy kĩ thuật được xác định bằng tỉ lệ
nhỏ nhất giữa RNA EGFR đột biến : EGFR kiểu dại mà quy trình ExBP-RT phát hiện được trong điều kiện tách biệt hẳn với tín hiệu nền được tạo ra bởi hiện tượng bắt cặp nhầm của mồi đặc hiệu đột biến gắn mồi vào khuôn RNA EGFR kiểu dại. Phân tích hồi quy tuyến tính khả năng phát hiện RNA EGFR đột biến được thực hiện bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism 9.0.2.
2.2.6. Thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu bệnh phẩm
Mô đúc nến sau khi thu thập được cắt thành các lắt cắt ngang với độ dày khoảng 10 μm và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Mẫu được lưu ở tủ 4oCđến khi tách chiết. Mẫu mô đúc nến được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Omega FFPE RNA/DNA Kit (Omega, USA) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Lượng mẫu đầu vào sử dụng khoảng 5-10 mg mẫu mô và thể tích RNA/DNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5-8 ml/lần được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. Trong vòng 2h sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm, tách huyết tương bằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết. Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi tách chiết. Mẫu huyết tương từ máu ngoại vi/dịch màng phổi được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Circulating Nucleic Acid
39
Kit (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thể tích huyết tương/dịch màng phổi được sử dụng để tách chiết là 2 mL và thể tích RNA/RNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
2.2.7. Phân tích đột biến trên mRNA bằng quy trình ExBP-RT đã tối ưu
Sau khi tối ưu thành công quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên RNA, tiến hành phân tích đột biến T790M/L858R trên các nhóm mẫu mRNA đã được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm. Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ thống máy realtime PCR Rotor Gene Q (Qiagen, Đức). Mỗi lượt chạy đều bao gồm đối chứng dương (PC) là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột