3.2.1. Tối ưu quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên RNA
Quy trình ExBP-RT one-step phát hiện đột biến EGFR T790M được thiết lập bằng cách tiến hành tối ưu điều kiện về nồng độ mẫu dò khóa, nồng độ mồi đặc hiệu và các chất phụ gia.
47
3.2.1.1. Tối ưu nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP
Để lựa chọn nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP có khả năng khóa tốt các RNA của EGFR kiểu dại trong quy trình phát hiện đột biến T790M, nghiên cứu sử dụng khuôn là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo của EGFR kiểu dại nồng độ ~106 bản sao/μl. Các nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP được đánh giá là 4 μM, 2 μM, 0,5 μM, 0,2 μM. Chất lượng của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá bằng cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số là T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P (Hình 12).
Hình 12: Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò khóa T790M_ExBP.
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR kiểu dại 106
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mẫu dò khóa 4 μM, 2 μM, 0,5 μM và 0,2 μM được chú thích màu như trong hình. Chứng âm NTC (đường màu đen) không có tín hiệu khuếch đại.
Tiêu chí lựa chọn là nồng độ mẫu dò khóa có khả năng khóa tốt nhất, tức là giá trị Ct của mẫu chuẩn RNA EGFR kiểu dại tổng hợp nhân tạo cao nhất. Kết quả cho thấy nồng độ mẫu dò khóa từ 4 μM đến 0,2 μM cho giá trị Ct dao động từ 30,73 đến 32,6. Trong đó, nồng độ mồi khóa 0,2 μM và 0,5 μM của mẫu dò khóa T790M_ExBP cho kết quả tốt nhất và tương tự nhau với giá trị Ct ~32 (Hình 12).
48
Hình 13: Kết quả so sánh nồng độ mồi khóa T790M_ExBP giữa 0.2 μM và 0.5 μM
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR kiểu dại 106
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mẫu dò khóa 0,5 μM và 0,2 μM được chú thích màu như trong hình. Chứng âm NTC (đường màu đen) không có tín hiệu khuếch đại.
Lặp lại thí nghiệm với nồng độ mồi khóa 0,2 μM và 0,5 μM để lựa chọn nồng độ mồi khóa thích hợp. Hình 13 cho thấy với nồng độ mồi khóa T790M_ExBP là 0,5 μM cho giá trị Ct là 33,52 và 33,94. Trong khi đó, với nồng độ mồi khóa T790M_ExBP là 0,2 μM cho giá trị Ct là 32,57 và 33,21. Như vậy, nồng độ mồi khóa 0,5 μM cho thấy khả năng khóa RNA của EGFR kiểu dại ổn định hơn và tốt hơn. Do vậy, nồng độ mồi khóa T790M_ExBP là 0,5 μM được sử dụng cho các thí nghiệm tối ưu tiếp theo.
3.2.1.2. Tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến T790M_RvS
Trong thí nghiệm tối ưu nồng độ mẫu dò khóa, nghiên cứu sử dụng mẫu chuẩn RNA EGFR kiểu dại nồng độ 106 bản sao/μl với mục đích đánh giá khả năng khóa của mẫu dò khóa trong điều kiện RNA kiểu dại cao. Điều này liên quan đến thực tế khi lượng RNA kiểu dại trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng thường cao hơn RNA mang đột biến. Trong thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến T790M_RvS, nghiên cứu lựa chọn chứng dương là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo của EGFR T790M nồng độ 103 bản sao/μl. Nồng độ chứng dương 103 bản sao/μl được sử dụng để có thể
49
xem xét được sự khác nhau của mỗi nồng độ mồi đặc hiệu đột biến hơn là sử dụng nồng độ chứng dương 106 bản sao/μl. Các nồng độ mồi đặc hiệu đột biến là được đánh giá là 0,4 μM (điều kiện ban đầu), 0,2 μM, 0,6 μM, 0,8 μM. Chất lượng của mẫu chuẩn EGFR T790M RNA tổng hợp nhân tạo được đánh giá bằng cặp mồi/đầu dò
khuếch đại RNA tổng số là T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P (Hình 14).
Hình 14: Kết quả tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến EGFR T790M_RvS.
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR T790M 103
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mồi đặc hiệu đột biến từ 0,2 μM, đến 0,8 μM được chú thích màu như trong hình. Chứng âm NTC (đường màu đen) không có tín hiệu khuếch đại.
Tiêu chí lựa chọn là nồng độ mồi đặc hiệu thấp nhất có khả năng khuếch đại mẫu chuẩn RNA EGFR T790M tổng hợp nhân tạo tốt nhất, tức có giá trị Ct thấp nhất. Kết quả cho thấy nồng độ mồi đặc hiệu đột biến từ 0,2 μM đến 0,8 μM cho giá trị Ct dao động từ 27,66 đến 28,73. Từ nồng độ mồi đặc hiệu đột biến T790M_RvS 0.4 μM 0,8 μM cho giá trị Ct của RNA mang đột biến tương đương với giá trị Ct của RNA tổng số. Trong đó, nồng độ mồi đặc hiệu 0,4 μM cho giá trị Ct sớm nhất (27,66) cũng như cường độ huỳnh quang cao nhất. Vì vậy, nồng độ 0,4 μM của mồi đặc hiệu đột biến T790M_RvS là nồng độ tối ưu được lựa chọn (Hình 14).
3.2.1.3. Tối ưu chất phụ gia
Các chất phụ gia như DMSO, BSA…thường được bổ sung trong phản ứng one-step RT-qPCR để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Nghiên cứu
50
tiến hành khảo sát một số chất phụ gia bao gồm Glycerol, BSA, DTT, DMSO ở các nồng độ khác nhau với khuôn là mẫu chuẩn RNA EGFR T790M tổng hợp nhân tạo.
DTT là chất phụ gia có khả năng nới lỏng cấu trúc bậc 2 của RNA, tạo điều kiện cho enzyme phiên mã ngược bám vào RNA dễ dàng hơn, từ đó nâng cao hiệu suất của phản ứng phiên mã ngược. Do vậy, nghiên cứu đã tiến hành so sánh đánh giá giữa có bổ sung và không bổ sung DTT 0,15 mM vào phản ứng, mỗi điều kiện được lặp lại 3 lần). Với điều kiện không bổ sung DTT, giá trị Ct trung bình của phản ứng 30,74 (30,58-30,83). Với điều kiện có bổ sung DTT, giá trị Ct trung bình của phản ứng là 30,67 (30,58-30,78). So sánh kết quả giữa hai điều kiện cho thấy DTT không làm tăng hiệu suất phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M RNA (Hình 15). Như vậy, DTT không được lựa chọn bổ sung vào phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M RNA.
Hình 15: Kết quả tối ưu nồng độ DTT.
Các phản ứng với điều kiện có bổ sung DTT (+)/không (-) bổ sung DTT 0,15 mM được chú thích màu như trong hình.
Nghiên cứu của Farel và công sự năm 2012 đã báo cáo BSA có khả năng tăng hiệu suất phản ứng PCR của khuôn giàu GC hơn khi kết hợp với dung môi hữu cơ [23]. Do vậy, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nồng độ BSA khác nhau trong glycerol với khuôn là mẫu chuẩn RNA EGFR T790M tổng hợp nhân tạo để tìm ra
51
điều kiện tối ưu nhất, phản ứng được lặp lại 2 lần. Nồng độ BSA và glycerol được thể hiện ở bảng 16.
Bảng 16: Các điều kiện BSA và glycerol sử dụng trong tối ưu chất phụ gia với phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA
Điều kiện BSA (μg/μl) Glycerol (%) Ct trung bình
1 0 0 30,21 2 0 2,5 30,48 3 0 5 30,84 4 1 2,5 31,06 5 2 5 32,24 6 3 2,5 30,17
Hình 16: Kết quả tối ưu nồng độ BSA và Glycerol.
Các phản ứng với 6 điều kiện về BSA và Glycerol ở bảng 16 được chú thích màu như trong hình
Với 6 điều kiện được khảo sát, giá trị Ct trung bình dao động từ 30,17 (điều kiện 6) đến 32,24 (điều kiện 5) (Bảng 16, Hình 16). So sánh giữa điều kiện 6 cho giá trị Ct trung bình thấp nhất (30,17) với điều kiện 1 – không bổ sung chất phụ gia với giá trị Ct trung bình là 30,21, thì không có khác biệt. Do vậy, BSA và glycerol không được lựa chọn để bổ sung vào phản ứng ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA.
52
DMSO thường được sử dụng trong các phản ứng PCR với các khuôn giàu GC (đoạn gen được khuếch đại có %GC là 67%), do vậy nghiên cứu tiến hành tối ưu phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA với DMSO nồng độ 0%, 2,5% và 5%, phản ứng được lặp lại 3 lần. Với điều kiện không bổ sung DMSO vào phản ứng, giá trị Ct trung bình 31,48 (31,38 – 31,65). Khi bổ sung DMSO 2,5% vào phản ứng, giá trị Ct trung bình là 30,08 (29,92 – 30,25). Với điều kiện DMSO 5%, phản ứng cho giá trị Ct trung bình là 27,05 (26,8 – 27,20). Như vậy, điều kiện bổ sung DMSO 5% vào phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA cho kết quả tốt nhất (Hình
17). Như vậy, điều kiện DMSO 5% được lựa chọn cho phản ứng phát hiện đột biến
EGFR T790M mRNA.
Hình 17: Kết quả tối ưu nồng độ DMSO trong phản ứng phát hiện đột biến
EGFR T790M mRNA.
Các phản ứng với điều kiện DMSO 5%, 2,5% và 0% được chú thích màu như trong hình
Như vậy, qua quá trình tối ưu một số điều kiện phản ứng, quy trình tối ưu cho phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 17 và chu trình nhiệt như bảng 6.
53
Bảng 17: Thành phần phản ứng tối ưu của phản ứng ExBP-RT phát hiện đột
biến EGFR T790M mRNA
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl/phản ứng)
1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4
2 Mồi xuôi T790M_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược đặc hiệu đột biến
T790M_RvS 10 μM
0,4 μM
0,8
4 Mẫu dò khóa T790M_ExBP 50 μM 0,5 μM 0,2
5 Đầu dò T790M_P 10 μM 0,2 μM 0,4
6 DMSO 100% 0,5% 1
6 Khuôn RNA 4
7 Nước xử lý DEPC 9,2
Tổng thể tích 20
3.2.2. Tối ưu quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR L858R trên RNA
Tương tự với tối ưu phản ứng phát hiện đột biến EGFR T790M trên RNA,
nghiên cứu tiến hành tối ưu phản ứng ExBP-RT trong một bước (one-step) RT-qPCR phát hiện đột biến EGFR L858R trên RNA về chất phụ gia DMSO, nồng độ mồi đặc hiệu và nồng độ mẫu dò khóa.
3.2.2.1. Tối ưu chất phụ gia DMSO
Với thành phẩn GC của gen đích EGFR L858R được khuếch đại là 54%, dựa vào kết quả tối ưu chất phụ gia trong phản ứng phát hiện đột biến T790M trên RNA, nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa phản ứng có/không bổ sung DMSO 5% vào phản ứng phát hiện đột biến L858R trên RNA với khuôn là mẫu chuẩn EGFR
L858R RNA tổng hợp nhân tạo. Phản ứng được lặp lại 2 lần. Với điều kiện có bổ sung DMSO 5% vào phản ứng cho giá trị Ct trung bình là 28,71. Với điều kiện không bổ sung DMSO vào phản ứng cho giá trị Ct trung bình là 28,99. Kết quả cho thấy
54
không có khác biệt giữa phản ứng có/không bổ sung DMSO vào phản ứng (Hình 18). Do vậy, DMSO không được bổ sung vào các thí nghiệm tối ưu tiếp theo.
Hình 18: Kết quả tối ưu DMSO trong phản ứng phát hiện đột biến EGFR
L858R mRNA.
Các phản ứng với điều kiện có bổ sung DMSO 5% không bổ sung DMSO được chú thích màu như trong hình
3.2.2.2. Tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến L858R_RvS
Nghiên cứu tiến hành tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến L858R_RvS trong phản ứng phát hiện đột biến L858R trên RNA với chứng dương là mẫu chuẩn EGFR L858R RNA tổng hợp nhân tạo nồng độ 103 bản sao/μl. Các nồng độ mồi L858R_RvS được dùng trong thí nghiệm là 0,4 μM (điều kiện ban đầu), 0,1 μM, 0,2 μM, 0,6 μM, 0,8 μM, 0,9 μM. Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá bằng cặp mồi tổng số L858R_Fw/L858R_RvT và đầu dò L858R_P (Hình 19).
55
Hình 19: Kết quả tối ưu nồng độ mồi đặc hiệu đột biến L858R_RvS trong phản ứng phát hiện đột biến EGFRL858R mRNA.
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR L858R 103
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mồi đặc hiệu đột biến từ 0,1 μM, đến 0,9 μM được chú thích màu như trong hình. Chứng âm NTC (đường màu đen) không có tín hiệu khuếch đại.
Tiêu chí lựa chọn là nồng độ mồi đặc hiệu đột biến khả năng khuếch đại mẫu chuẩn RNA EGFR L858R tổng hợp nhân tạo tốt nhất, tức là có giá trị Ct thấp nhất. Kết quả cho thấy nồng độ mồi đặc hiệu đột biến từ 0,1 μM đến 0,9 μM cho giá trị Ct dao động từ 36,78 đến 27,17. Nồng độ mồi đặc hiệu đột biến thấp (0,1 μM và 0,2 μM) cho giá trị Ct muộn (36,78 → 33,75). Tăng nồng độ mồi đặc hiệu đột biến lên thì giá trị Ct của phản ứng phát hiện đột biến EGFR L858R trên RNA cũng giảm
xuống. Trong đó, nồng độ mồi đặc hiệu 0,8 μM và 0,9 μM cho giá trị Ct sớm nhất (27,32 và 27,17) (Hình 18). Do vậy, nồng độ mồi đặc hiệu đột biến L858R_RvS tối ưu được lựa chọn là 0,9 μM để thực hiện các thí nghiệm tối ưu tiếp theo.
3.2.2.3. Tối ưu nồng độ mẫu dò khóa L858R_ExBP
Với nồng độ mồi đặc hiệu đột biến L858R_RvS được lựa chọn, nghiên cứu tiếp tục tiến hành tối ưu nồng độ mồi khóa L858R_ExBP trong phản ứng phát hiện đột biến EGFR L858R. Mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo của EGFR kiểu dại nồng độ 105 bản sao/μl được lựa chọn làm khuôn cho phản ứng. Nồng độ cao của RNA
EGFR kiểu dại được sử dụng là các mẫu bệnh phẩm lâm sàng trong thực tế thường
có chứa RNA EGFR kiểu dại tương đối nhiều, nhiều hơn các RNA EGFR mang đột biến. Các nồng độ mẫu dò khóa L858R_ExBP được đánh giá trong thí nghiệm là 8 μM, 6 μM, 4 μM, 2 μM, 0,5 μM. Chất lượng của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
56
được đánh giá bằng cặp mồi/đầu dò khuếch đại mRNA tổng số L858R_Fw/L858R_RvT/L858R_P (Hình 20).
Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò khóa L858R_ExBP trong phản ứng phát hiện đột biến EGFR L858R mRNA.
Đường cong khuếch đại của phản ứng đánh giá lượng RNA tổng số của EGFR kiểu dại 105
bản sao/μl được biểu diễn bằng đường màu đỏ tươi. Các phản ứng với nồng độ mẫu dò khóa từ 8 μM đến 0,5 μM được chú thích màu như trong hình.
Khi tăng nồng độ mồi đặc hiệu đột biến lên 1,8 μM, để khóa có hiệu quả cần tăng nồng độ mẫu khóa lên để cạnh tranh với mồi đặc hiệu đột biến một cách có hiệu quả. Tiêu chuẩn lựa chọn nồng độ mẫu dò khóa là nồng độ mẫu dò khóa thấp nhất có khả năng khóa mẫu chuẩn EGFR kiểu dại RNA một cách hiệu quả nhất. Với nồng độ mẫu dò khóa là 6 μM và 8 μM không thấy tín hiệu khuếch đại nhầm của mồi đặc hiệu đột biến với EGFR kiểu dại RNA. Như vậy EGFR kiểu dại RNA đã được khóa hoàn toàn. Do vậy nồng độ mồi khóa là 6 μM được lựa chọn để tiếp tục đánh giá độ nhạy của quy trình phát hiện đột biến EGFR L858R (Hình 20).
Như vậy, qua quá trình tối ưu một số điều kiện phản ứng, quy trình tối ưu cho phản ứng phát hiện đột biến EGFR L858R mRNA với thành phần phản ứng được
57
Bảng 18: Thành phần phản ứng tối ưu của phản ứng phản hiện đột biến EGFR
L858R mRNA
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl/phản ứng)
1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4
2 Mồi xuôi L858R_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược đặc hiệu đột biến
L858R_RvS 10 μM
0,9 μM
1,8
4 Mẫu dò khóa L858R_ExBP 50 μM 6 μM 2,4
5 Đầu dò L858R_P 10 μM 0,2 μM 0,4
6 Khuôn RNA 4
7 Nước xử lý DEPC 7
Tổng thể tích 20
3.3. Đánh giá quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR L858R trên RNA đã được tối ưu
3.3.1. Đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến
EGFR L858R trên RNA với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Nghiên cứu áp dụng quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR L858R trên RNA đã được tối ưu để đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình trên mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo với dải tỉ lệ nồng độ của RNA EGFR L858R : EGFR kiểu dại từ 1 đến 10-5. Kết quả cho thấy RNA EGFR L858R được phát hiện trên nền RNA EGFR kiểu dại với tỉ lệ lớn 1:100.000, tức tương đương với độ nhạy 0,001% (Hình 21). Phân