mRNA đã được tối ưu
Nghiên cứu tiếp tục đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến RNA EGFR T790M mRNA trên mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo và độ nhạy/độ đặc hiệu lâm sàng trên nhóm mẫu bệnh phẩm lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN trước điều trị. Sử dụng các mẫu sinh thiết lỏng (dịch màng phổi/máu ngoại vi) của các bệnh nhân UTPKTBN đang điều trị đích để đánh giá khả năng áp dụng của quy trình này trong theo dõi các bệnh nhân UPTKTBN trong quá trình điều trị đích.
3.4.1. Đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến RNA EGFR T790M với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Nghiên cứu áp dụng quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến RNA T790M đã được tối ưu để đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình trên mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo với tỉ lệ nồng độ RNA EGFR T790M : EGFR kiểu dại từ 10-1 đến 10-5. Kết quả cho thấy RNA T790M được phát hiện trên nền RNA EGFR kiểu dại với tỉ lệ
1:100.000, tức tương đương với độ nhạy 0,001% (Hình 23). Phân tích hồi qua tuyến tính đơn giản bằng phần mềm GraphPad Prism 9.0.2 cho thấy khả năng phát hiện đột biến RNA T790M trên nền RNA EGFR kiểu dại nồng độ 106 bản sao/μl là tuyến tính từ tỉ lệ 1:100.000 đến 1:10 với r2=0,966 (Hình 24). Phản ứng chứng âm (NTC) hoàn toàn không thấy tín hiệu khuếch đại. Như vậy, với độ nhạy kĩ thuật 0,001%, quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến điểm EGFR T790M trên mRNA có khả năng phát hiện được đột biến gen với tần suất đột biến trên 0,005%. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của quy trình phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA trong phát hiện đột biến ở các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
64
Hình 23: Độ nhạy kĩ thuật quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR
T790M trên mRNA.
Đường cong khuếch đại của dải pha loãng mẫu chuẩn EGFR T790M RNA tổng hợp nhân tạo trong nền mẫu chuẩn EGFR kiểu dại RNA tổng hợp nhân tạo (từ trái qua phải) 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, RNA EGFR kiểu dại (đường màu đỏ) và chứng âm NTC (đường màu đen).
Hình 24: Đường tuyến tính biểu diễn giá trị Ct trung bình (2 lần lặp lại) của dải pha loãng các tỉ lệ RNA EGFR L858R : EGFR kiểu dại
Dựa vào kết quả đánh giá độ nhạy kĩ thuật quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA đã trình bày ở trên, giá trị ∆Ct cut-off được lựa chọn để sử dụng cho phân tích đột biến EGFR T790M trên mRNA ở mẫu bệnh phẩm là
∆Ct = 14. Giá trị cut-off này tương đương với khả năng phát hiện % đột biến trong mẫu là 2-∆Ct x 100% = 0,006%.
65
3.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện đột biến điểm EGFR T790M trên mRNA ở nhóm bệnh nhân UTPKTNB trước điều trị nhóm bệnh nhân UTPKTNB trước điều trị
Khi đánh giá trên 5 mẫu dương tính và 44 mẫu âm tính với đột biến gen EGFR T790M của bệnh nhân UTPKTBN trước điều trị, so sánh với kết quả phát hiện đột biến trên khuôn DNA, quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên
mRNA độ nhạy lâm sàng 100%, độ đặc hiệu lâm sàng 100%. Kết quả có ý nghĩa thống kê với hệ số Cohen’s Kappa = 1 và p < 0,0005. Điều này cho thấy tiềm năng trong phân tích đột biến bằng kỹ thuật mới trên khuôn RNA (Bảng 22).
Bảng 22: Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác lâm sàng của quy trình phát hiện đột biến EGFR T790M trêm mRNA ở nhóm bệnh nhân trước điều trị
DNA (ARMS) RNA (ExBP_RT) Dương tính Âm tính Độ nhạy Độ đặc hiệu Độ chính xác Hệ số Cohen’s Kappa Dương tính 5 0 100 (47.82- 100,0) 100 (91,96- 100,0) 100 (92,75 – 100,0) 1,000 (P<0,0005) Âm tính 0 44
Trên 5 mẫu dương tính với đột biến EGFR T790M trên mRNA, tỉ lệ Ct dao
động giữa RNA đột biến/RNA tổng số là từ 0,236% - 2,368% (Bảng 23). Trên 44 mẫu âm tính với EGFR T790M trên DNA cũng đều cho kết quả âm tính với quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA với ∆Ct mẫu >14 = ∆Ct cut- off (Phụ lục 2).
Bảng 23: Kết quả phân tích đột biến EGFR T790M trên mRNA với các mẫu đã xác định dương tính bằng quy trình ExBP-RT
STT Loại mẫu Ctrl (Ct) ∆Ct_TB (T790M - Ctrl) 2-∆Ct (%) 1 Mô đúc nến 19,68 6,24 1,323 2 Mô đúc nến 20,83 7,42 0,584 3 Mô đúc nến 20,49 6,17 1,389 4 Mô đúc nến 26,12 8,73 0,236 5 Mô đúc nến 25,52 5,40 2,368
66
3.4.3. Đánh giá tiềm năng ứng dụng của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến
EGFR T790M trên mRNA với các mẫu sinh thiết lỏng
Đột biến EGFR T790M là đột biến kháng thuốc thứ phát xuất hiện trong quá trình điều trị đích. Với những đột biến kháng thuốc này, để phát hiện đột biến bằng các quy trình thường quy thường gặp khó khăn do khả năng sinh thiết lấy mô trong quá trình theo dõi điều trị là không dễ dàng. Với bệnh nhân đang điều trị đích, sinh thiết lấy mẫu mô là khó do khó xác định vị trí khối u và nguy cơ gây biến chứng cho bệnh nhân. Việc phát hiện đột biến kháng thuốc xuất hiện trong quá trình điều trị đích trên mẫu sinh thiết lỏng sẽ mở ra tiềm năng trong nâng cao hiệu quả của phương pháp điều trị đích. Do vậy, nghiên cứu tiếp tục đánh giá quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA trên nhóm mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân UTP trong quá trình điều trị - nhóm mẫu có tỉ lệ đột biến EGFR T790M cao, 34% - 56.6% [16, 53].
Trước khi đánh giá trên nhóm mẫu của bệnh nhân UTP trong quá trình điều trị, tiến hành đánh giá độ đặc hiệu của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến RNA
EGFR T790M trên 40 mẫu máu ngoại vi của tình nguyện viên khỏe mạnh. 0/40 mẫu
cho kết quả EGFR T790M dương tính (Hình 25, Phụ lục 3). Kết hợp với kết quả trên mẫu trước điều trị, cho thấy độ đặc hiệu của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến
EGFR T790M trên mRNA là 100%.
Hình 25: Kết quả phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA ở nhóm người khỏe mạnh bằng quy trình ExBP-RT
67
Tiếp đó, khả năng ứng dụng của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA được đánh giá bằng cách phân tích đột biến trên khuôn RNA tách từ nhóm mẫu của bệnh nhân UTP trong quá trình điều trị đích. Sử dụng ngưỡng phát hiện là ∆Ct cut-off là 14 để phân biệt mẫu mang hoặc không mang đột biến. Các mẫu có ∆Ct < 14 là các mẫu mang đột biến và ngược lại đối với các mẫu không mang đột biến.
64 bệnh nhân có đột biến nhạy thuốc được điều trị đích với EGFR TKI được lấy mẫu sinh thiết lỏng (dịch màng phổi hoặc mẫu máu ngoại vi) sau 9-12 tháng điều trị. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân này được trình bày ở bảng 24. Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân đang điều trị được thu thập là 59 (34-79) tuổi, tập trung nhiều nhất ở độ tuổi 50-69 và phần lớn bệnh nhân là nữ (56%).
Bảng 24: Đặc điểm và kết quả phát hiện đột biến EGFR T790M mRNA bằng quy trình ExBP-RT trên nhóm bệnh nhân đang điều trị đích
Đặc điểm Kết quả trên RNA P
Dương tính Tổng số % Cỡ mẫu 26 64 40,63 Giới tính Nam 8 27 29,93 0,129 Nữ 18 37 48,65 Độ tuổi (34-79, Trung bình 58) <40 0 3 0 0,204 40-49 2 6 33,33 50-59 11 27 40,74 60-69 10 23 43,48 >70 3 5 60,00 Loại mẫu Dịch màng phổi 6 10 60 0,178 Máu ngoại vi 20 54 37,04
Kết quả phân tích đột biến mRNA T790M thứ phát cho thấy, có 26/64 mẫu sinh thiết lỏng của bệnh nhân UTPKTBN đang điều trị (chiếm 40,63% tổng số mẫu) có dương tính với đột biến gen này (Bảng 24). Tỉ lệ phát hiện đột biến mRNA T790M trong mẫu sinh thiết lỏng ở nghiên cứu này thấp hơn một số nghiên cứu về tần suất xuất hiện đột biến T790M thứ phát trên mẫu mô bệnh phẩm ở bệnh nhân UTPKTBN
68
(50-60%) [61, 94, 124]. Tuy nhiên kết quả trên cao hơn tần suất đột biến T790M thứ phát trên mẫu sinh thiết mô ở một nghiên cứu ở Nhật Bản (34,4%) [53].
Tỉ lệ phát hiện đột biến T790M thứ phát trên mẫu sinh thiết lỏng của bệnh nhân UTPKTBN ở nghiên cứu này (40,63%) thấp hơn so với nghiên cứu của Babu Koyyala, V.P. trên 24 mẫu sinh thiết lỏng bệnh nhân người Ấn Độ mắc UTPKTBN di căn sau điều trị (45,83%) [7]. Nghiên cứu [7] không chỉ rõ mẫu sinh thiết lỏng được sử dụng là loại mẫu nào. Khi so sánh khả năng phát hiện đột biến T790M thứ phát trên mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân UTPKTBN ở nghiên cứu này so với nghiên cứu khác trên thế giới, nghiên cứu này cho tỉ lệ phát hiện đột biến T790M (37,04%) tương đương với khả năng phát hiện đột biến T790M bằng công nghệ ddPCR (35%) [12]. Tỉ lệ này thấp hơn so với kết quả phát hiện đột biến bằng phương pháp ARMS do nhóm nghiên cứu của Chen và cộng sự phát triển (42,5%) nhưng cho giá trị cao hơn các bộ kit thương mại hiện nay trong phát hiện đột biến T790M trong mẫu máu ngoại vi hiện nay (Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit – 22,5% và Cobas EGFR Mutation kit – 17,5%) [12]. So sánh kết quả phát hiện đột biến mRNA T790M
thứ phát trên mẫu dịch màng phổi trên, nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ phát hiện tương đương với nghiên cứu của Tsai và cộng sự (60% (6/10) và 54,2% (13/24)) [106].
Bên cạnh đó, nghiên cứu không phát hiện thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng đột biến RNA T790M với giới tính giới tính (p = 0,129), độ tuổi (p = 0,204) hay loại mẫu (p = 0,178). Kết quả này tương đồng với một số nghiên cứu trên thế giới [44, 53, 65]. Nghiên cứu này cho thấy tần suất xuất hiện đột biến T790M với nữ giới (48,65%) là cao hơn ở nam giới (31,03%). Tần suất xuất hiện đột biến T790M ngày càng tăng khi độ tuổi của bệnh nhân ngày càng lớn (từ 33,33% ở độ tuổi 40-49 → 50% ở độ tuổi > 70). Mẫu dịch màng phổi có khả năng phát hiện được đột biến T790M cao hơn so với mẫu máu (60% so với 37,04%). Điều này có thể do giới hạn phát hiện của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến mRNA T790M khi lượng mRNA đột biến lưu hành trong máu ngoại vi thường thấp hơn so với lượng mRNA đột biến trong mẫu dịch màng phổi. Bảng 25 trình bày về tỉ lệ % đột biến của các mẫu dương tính với EGFR T790M trên mRNA đã cho thấy quy trình đã phát hiện đột biến mRNA T790M từ 0,009% - 2,32%.
69
Bảng 25: Kết quả các mẫu dương tính EGFR T790M trên mRNA
STT Loại mẫu Ctrl (Ct) ∆Ct_TB (CtT790M – Cttổng số) 2-∆Ct (%) 1 Máu ngoại vi 26,6 13,47 0,009 2 Máu ngoại vi 24,29 13,33 0,01 3 Máu ngoại vi 29,25 12,23 0,021 4 Dịch màng phổi 23,05 11,65 0,031 5 Máu ngoại vi 27,43 11,68 0,031 6 Máu ngoại vi 25,23 11,51 0,034 7 Máu ngoại vi 25,36 11,34 0,039 8 Máu ngoại vi 24,2 10,96 0,05 9 Máu ngoại vi 26,04 10,89 0,053 10 Máu ngoại vi 23,7 10,66 0,062 11 Dịch màng phổi 21,01 10,6 0,065 12 Máu ngoại vi 23,57 10,57 0,066 13 Dịch màng phổi 22,39 10,4 0,074 14 Máu ngoại vi 24,58 10,21 0,085 15 Máu ngoại vi 24,28 9,52 0,136 16 Máu ngoại vi 24,07 8,57 0,263 17 Dịch màng phổi 20,72 8,55 0,268 18 Dịch màng phổi 23,52 8,48 0,28 19 Máu ngoại vi 24,68 8,4 0,296 20 Máu ngoại vi 26,09 7,96 0,402 21 Máu ngoại vi 29,71 7,69 0,486 22 Máu ngoại vi 27,5 7,65 0,5 23 Máu ngoại vi 23,39 7,65 0,5 24 Máu ngoại vi 30,69 6,54 1,075 25 Dịch màng phổi 20,62 6,17 1,389 26 Máu ngoại vi 26,12 5,43 2,32
70
này tồn tại một số hạn chế. Thứ nhất, số lượng mẫu mang đột biến EGFR T790M
được sử dụng để đánh giá độ nhạy lâm sàng là ít (5). Điều này là do tỉ lệ đột biến
EGFR T790M nguyên phát của bệnh nhân UTPKTNB trước điều trị là thấp (<5%)
[44] nên nghiên cứu chưa thu thập được số lượng lớn mẫu mô đúc nến mang đột biến này. Thứ hai, với các bệnh nhân UTPKTBN đang được điều trị đích, nghiên cứu cũng chưa thu thập được mẫu mô khối u. Hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung thu thập mẫu đầy đủ để tiến hành so sánh toàn diện hơn giữa mẫu mô đúc nến và mẫu sinh thiết lỏng của cùng một bệnh nhân UTPKTBN đang điều trị đích.
Quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA đạt được
độ nhạy kỹ thuật cao (0,006%), cao gấp hơn ~ 15 lần so với kỹ thuật phát hiện đột biến dựa trên khuôn DNA như giải trình tự thế hệ mới (> 0,1%) [22, 115]. Bên cạnh đó, sử dụng mẫu sinh thiết lỏng cho các xét nghiệm đang là xu thế trong y học hiện nay do khả năng linh hoạt trong sử dụng, có thể lặp lại nhiều lần, nhiều thời điểm khác nhau cũng như ít gây đau đớn cho bệnh nhân, nhất là các bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn [92], từ đó có thể bổ trợ cho các xét nghiệm không lấy được mẫu mô hoặc sử dụng song song với xét nghiệm trên mẫu mô để tránh bỏ sót đột biến do hiện tượng không đồng nhất trên mẫu mô. Do vậy kỹ thuật ExBP-RT có tiềm năng trong ứng dụng theo dõi bệnh sau điều trị trên mẫu bệnh phẩm sinh thiết lỏng. Các bệnh nhân phát hiện đột biến EGFR T790M trên mẫu sinh thiết lỏng sẽ được thay đổi sang thuốc điều trị thế hệ thứ ba. Các bệnh nhân âm tính với đột biến EGFR T790M trên mẫu máu ngoại vi sẽ phải tiến hành lấy mẫu sinh thiết lại của khối u để thực hiện lại xét nghiệm. Như vậy, các quy trình giúp phát hiện đột biến EGFR T790M trong các mẫu sinh thiết lỏng giúp hạn chế việc lấy mẫu sinh thiết mô nhiều lần ở các bệnh nhân UTPKTBN đang theo dõi điều trị đích. Từ đó giúp hạn chế sự đau đớn, nguy cơ tai biến do lấy mẫu sinh thiết mô và tăng chất lượng cuộc sống của các bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn.
71
KẾT LUẬN
1. Thiết lập thành công quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến EGFR
L858R/T790M trên mRNA với độ nhạy kĩ thuật cao (0,006%).
2. Phát hiện đột biến EGFR L858R trên mRNA với độ nhạy lâm sàng 100%, độ đặc hiệu lâm sàng 98,2%.
Phát hiện đột biến EGFR T790M trên mRNA với độ nhạy lâm sàng 100%, độ đặc hiệu lâm sàng 100%. Với nhóm mẫu UTPKTBN đang điều trị đích, tỉ lệ đột biến EGFR T790M thứ phát trên mRNA là 40,63%.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục thu thập số lượng mẫu lớn để đánh giá tiếp hiệu quả lâm sàng của các quy trình phát hiện đột biến điểm trên RNA.
2. Thu thập mẫu mô đúc nến và mẫu máu của cùng một bệnh nhân để đánh giá khả năng áp dụng quy trình với trên mẫu sinh thiết lỏng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Huỳnh Quyết Thắng and Thi, Châu Phú (2019), "Điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ (Từ trị liệu kinh điển đến miễn dịch liệu pháp)".
2. Nguyễn Thị Lan Anh (2017), "Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen EGFR và mối liên quan với lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi biểu mô tuyến", Nội hô hấp.
Website
3. "GLOBOCAN 2020, https://gco.iarc.fr/today/".
4. "Catalog Of Somatic Mutation In Cancer (COSMIC), Mutation COSV51765161,
https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/mutation/overview?id=95491007".
Tiếng Anh
5. Alam, S., Pal, A., Kumar, R., Dwivedi, P. D., Das, M., and Ansari, K. M. (2014), "EGFR-mediated Akt and MAPKs signal pathways play a crucial role in patulin-induced cell proliferation in primary murine keratinocytes via modulation of Cyclin D1 and COX-2 expression", Mol Carcinog, 53(12), pp. 988-98.
6. Arcila, M. E., Oxnard, G. R., Nafa, K., Riely, G. J., Solomon, S. B., Zakowski, M. F., Kris, M. G., Pao, W., Miller, V. A., and Ladanyi, M. (2011), "Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay", Clin Cancer Res, 17(5), pp. 1169-80.
7. Babu Koyyala, V. P., Batra, U., Jain, P., Sharma, M., Goyal, P., Medisetty, P., Jajodia, A., and Maheshwari, U. D. (2018), "Frequency of T790M mutations after progression on epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor in metastatic non-small cell lung cancer in Indian patients: real-time data from