Phiên mã là quá trình tổng hợp RNA từ mạch khuôn DNA, được xúc tác bởi enzyme DNA-dependent RNA polymerase và thực hiện theo nguyên tắc bổ sung. Phiên mã tổng hợp nhân tạo là một quá trình đơn giản cho phép tổng hợp lượng lớn phân tử RNA trực tiếp từ bất kì trình tự oligonucleotide với chiều dài vài chục base đến vài kilobase.
2.2.3.1. Tạo mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Plasmid sau khi đặt hàng và nhận từ nhà sản xuất (GenScript Biotech, USA) ở dạng đông khô được pha về nồng độ 100 ng/μl.
Bước 1: Sử dụng enzyme cắt giới hạn XhoI (R0146S, NEB, Mỹ) để cắt plasmid từ dạng vòng thành dạng thẳng
Để tạo được các bản sao RNA có chiều dài xác định, plasmid DNA phải được cắt hoàn toàn thành dạng thẳng bằng enzyme cắt giới hạn nằm sau gen đích. Ngược lại, nếu sử dụng plasmid dạng vòng sẽ tạo ra các bản sao RNA có chiều dài khác nhau
33
do hiệu năng cao của T7 RNA Polymerase. Trong nghiên cứu này, XhoI được lựa
chọn bởi chỉ có duy nhất 1 vị trí nhận biết enzyme cắt XhoI trong plasmid khuôn và vị trí này nằm sau đoạn gen đích chèn vào vector.
Phản ứng cắt với enzyme XhoI (R0146S, NEB, Mỹ) được thực theo hướng dẫn của nhà sản xuất, với tổng thể tích phản ứng là 50 μl. Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 60 phút trên máy PCR.
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộ kit Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (T1030S, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Kết quả thu được 20 µl sản phẩm plasmid dạng thẳng đã được tinh sạch để làm khuôn cho quá trình phiên mã.
Bước 3: Tổng hợp mẫu chuẩn RNA bằng bộ HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis (E2050, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 4 giờ trên máy PCR
Bước 4: Xử lý với DNase để loại bỏ khuôn DNA ở 37oC trong 15 phút.
Bước 5: Tinh sạch RNA tổng hợp nhân tạo với Monarch® RNA Cleanup Kit (T2050L, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3.2. Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo
Bước 1: Đánh giá độ tinh sạch và nồng độ của mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp quang phổ:
Độ tinh sạch và nồng độ mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được xác định bằng cách đo phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng máy đo quang phổ nanodrop (ND1000, Thermo Scientific).
Số lượng bản sao của RNA tổng hợp nhân tạo được tính bằng phần mềm online Nebiocalculator (https://nebiocalculator.neb.com/#!/ssrnaamt)
Bước 2: Đánh giá kích thước sản phẩm bằng phương pháp điện di
Mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo được điện di thường để kiểm tra kích thước trên gel agarose 2% và Low Range ssRNA Ladder (N0364S, NEB, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các RNA được biến tính ở 70oC/10 phút ở máy PCR
34
thường và được làm lạnh ngay ở trên khay đá lạnh. Điện di được thực hiện ở 70V trong 80 phút.
Bước 3: Đánh giá mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo bằng cặp mồi tổng số
Pha loãng mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo xuống nồng độ 105 bản sao/μl dựa vào kết quả đo bằng nanodrop và kiểm tra bằng phương pháp RT-qPCR với cặp mồi khuếch đại RNA tổng số. Để đánh giá và đưa ra kết luận về quá trình RNA tổng hợp được tốt và không lẫn DNA trong RNA thu được, sử dụng phương pháp tiến hành đối chiếu kết quả giữa điều kiện có/không có enzyme phiên mã ngược trong thành phần phản ứng.
Với cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số của EGFR kiểu dại và T790M là T790M_Fw/ T790M_RvT/ T790M_P (Hình 10): Thực hiện phản ứng với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến T790M 105 bản sao/μl, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại 105 bản sao/μl và chứng âm NTC. Phản ứng one- step RT-qPCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl với thành phần phản ứng như bảng 4 và chu trình nhiệt như bảng 6. Phản ứng đánh giá DNA lẫn trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo T790M và EGFR kiểu dại sau phiên mã được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl với thành phần phản ứng như bảng 5 và chu trình nhiệt bảng 6.
Bảng 4: Thành phần phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số bằng cặp mồi T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm RT-qPCR HPNE 5X 1X 4 2 DMSO 100% 2,5% 0,5 3 Mồi xuôi T790M_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 4 Mồi ngược T790M_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 5 Đầu dò T790M_P 10 μM 0,2 μM 0,4 6 Nước xử lý DEPC 9,9 7 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
35
Bảng 5: Thành phần phản ứng khuếch đại DNA EGFR tổng số bằng cặp mồi T790M_Fw/T790M_RvT/T790M_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm qPCR HPN 5X 1X 4 2 DMSO 100% 2,5% 0,5 3 Mồi xuôi T790M_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 4 Mồi ngược T790M_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 5 Đầu dò T790M_P 10 μM 0,2 μM 0,4 6 Nước xử lý DEPC 9,9 7 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
Bảng 6: Chu trình nhiệt one-step RT-qPCR
Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị
Phiên mã ngược Ủ 50 10 phút
Hạ nhiệt 50 40 1 độ/1 phút
Bất hoạt RTx + Biến tính + hoạt hóa Taq 95 15 phút
Khuếch đại Biến tính 94 15 giây
Chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 giây
Kéo dài (Green) 72 30 giây
Với cặp mồi/đầu dò khuếch đại RNA tổng số của EGFR kiểu dại và L858R là L858R_Fw/L858R_RvT/ L858R_P (Hình 10): Thực hiện phản ứng với mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến L858R 105 bản sao/μl, mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo EGFR kiểu dại 105 bản sao/μl và chứng âm NTC. Phản ứng one-step RT-qPCR được thực hiện với tổng thể tích 20 μl và thành phần phản ứng như bảng 7, chu trình nhiệt như bảng 6. Phản ứng đánh giá DNA lẫn trong mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo L858R và EGFR kiểu dại sau phiên mã được thực hiện với tổng
36
Bảng 7: Thành phần phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số bằng cặp mồi L858R_Fw/L858R_RvT/L858R_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4 2 Mồi xuôi L858R_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược L858R_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 4 Đầu dò L858R_P 10 μM 0,2 μM 0,4 5 Nước xử lý DEPC 10,4 6 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
Bảng 8: Thành phần phản ứng khuếch đại DNA EGFR tổng số bằng cặp mồi L858R_Fw/L858R_RvT/L858R_P STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) 1 Đệm qPCR HPN 5X 1X 4 2 Mồi xuôi L858R_Fw 10 μM 0,2 μM 0,4 3 Mồi ngược L858R_RvT 10 μM 0,4 μM 0,8 4 Đầu dò L858R_P 10 μM 0,2 μM 0,4 5 Nước xử lý DEPC 10,4 6 Khuôn 4 Tổng thể tích 20
2.2.4. Tối ưu quy trình phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA
Với quy trình two-step được trình bày ở nghiên cứu trước [110], nghiên cứu tiến hành gộp thành phần và chu trình của quy trình two-step thành quy trình one- step như bảng 9 và bảng 6:
37
Bảng 9: Thành phần phản ứng ban đầu của quy trình one-step
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl/phản ứng)
1 Đệm RT-PCR HPNE 5X 1X 4
2 Mồi xuôi Fw_10 μM 0,2 μM 0,4
3 Mồi ngược đặc hiệu đột biến_10 μM 0,4 μM 0,8
4 Mẫu dò khóa_50 μM 4 μM 1,6
5 Đầu dò_10 μM 0,2 μM 0,4
6 Khuôn RNA 4
7 Nước xử lý DEPC 8,8
Tổng thể tích 20
Sau khi đánh giá kết quả phát hiện đột biến bằng quy trình one-step trên khuôn RNA tổng hợp nhân tạo, tiếp tục tối ưu quy trình với các chất phụ gia (bao gồm Glycerol, BSA, DTT, DMSO), nồng độ mồi và điều kiện phản ứng khác.
2.2.5. Đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA
Để đánh giá độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M và L858R trên RNA, sử dụng mẫu chuẩn RNA mang đột biến tương ứng trộn với RNA EGFR kiểu dại theo các tỉ lệ khác nhau. RNA EGFR kiểu dại 106 bản sao/μl được trộn với các nồng độ khác nhau của RNA EGFR đột biến (106 đến 101 bản sao/μl). Kết quả tạo thành dải các tỉ lệ khác nhau giữa RNA EGFR đột biến : RNA EGFR kiểu dại, từ 10-1 đến 10-5 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) cho đột biến T790M (Bảng 10) và từ 1 đến 10-5 (1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) cho đột biến L858R (Bảng 11).
Bảng 10: Dải tỉ lệ trộn của RNA T790M : RNA EGFR kiểu dại
Nồng độ RNA
T790M (bản sao/μl)
Nồng độ RNA EGFR
kiểu dại (bản sao/μl)
Tỉ lệ thể tích được trộn
RNAT790M : RNA
EGFR kiểu dại
105 106 1:1 10-1
104 106 1:1 10-2
103 106 1:1 10-3
102 106 1:1 10-4
38
Bảng 11: Dải tỉ lệ trộn của RNA L858R : RNA EGFR kiểu dại
Nồng độ RNA
L858R (bản sao/μl)
Nồng độ RNA EGFR
kiểu dại (bản sao/μl)
Tỉ lệ thể tích được trộn
RNAL858R : RNA
EGFR kiểu dại
106 106 1:1 1 105 106 1:1 10-1 104 106 1:1 10-2 103 106 1:1 10-3 102 106 1:1 10-4 101 106 1:1 10-5
Độ nhạy kĩ thuật của quy trình ExBP-RT phát hiện từng loại đột biến EGFR được xác định bằng khả năng phát hiện được RNA EGFR đột biến trong nền của 106 bản sao/μl RNA EGFR kiểu dại. Tức là, độ nhạy kĩ thuật được xác định bằng tỉ lệ
nhỏ nhất giữa RNA EGFR đột biến : EGFR kiểu dại mà quy trình ExBP-RT phát hiện được trong điều kiện tách biệt hẳn với tín hiệu nền được tạo ra bởi hiện tượng bắt cặp nhầm của mồi đặc hiệu đột biến gắn mồi vào khuôn RNA EGFR kiểu dại. Phân tích hồi quy tuyến tính khả năng phát hiện RNA EGFR đột biến được thực hiện bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism 9.0.2.
2.2.6. Thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu bệnh phẩm
Mô đúc nến sau khi thu thập được cắt thành các lắt cắt ngang với độ dày khoảng 10 μm và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Mẫu được lưu ở tủ 4oCđến khi tách chiết. Mẫu mô đúc nến được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Omega FFPE RNA/DNA Kit (Omega, USA) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Lượng mẫu đầu vào sử dụng khoảng 5-10 mg mẫu mô và thể tích RNA/DNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5-8 ml/lần được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. Trong vòng 2h sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm, tách huyết tương bằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen. Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết. Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi tách chiết. Mẫu huyết tương từ máu ngoại vi/dịch màng phổi được tách chiết RNA/DNA bằng bộ kit Circulating Nucleic Acid
39
Kit (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thể tích huyết tương/dịch màng phổi được sử dụng để tách chiết là 2 mL và thể tích RNA/RNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µl. RNA/DNA sau tách chiết được lưu ở tủ -80oC đến khi phân tích.
2.2.7. Phân tích đột biến trên mRNA bằng quy trình ExBP-RT đã tối ưu
Sau khi tối ưu thành công quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên RNA, tiến hành phân tích đột biến T790M/L858R trên các nhóm mẫu mRNA đã được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm. Quy trình phân tích được thực hiện trên hệ thống máy realtime PCR Rotor Gene Q (Qiagen, Đức). Mỗi lượt chạy đều bao gồm đối chứng dương (PC) là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo mang đột biến, chứng âm (NC) là mẫu chuẩn RNA tổng hợp nhân tạo kiểu dại và chứng âm nước (NTC). Đối với mỗi mẫu, bên cạnh phản ứng phát hiện đột biến được thực hiện lặp lại 2 lần, một phản ứng khuếch đại RNA EGFR tổng số đánh giá chất lượng mẫu cũng được thực hiện song song.
Phân tích mẫu mang/không mang đột biến được dựa vào giá ∆Ct. ∆Ct được tính bằng hiệu số Ct giữa phản ứng đặc hiệu đột biến và phản ứng tổng số, theo công thức:
∆Ct = Ctđột biến - CtRNA tổng số
Trong đó, Ctđột biến là giá trị Ct của phản ứng RT-qPCR khuếch đại RNA EGFR đột
biến; CtRNA tổng số là giá trị Ct của phản ứng RT-qPCR khuếch đại RNA EGFR tổng
số. Giá trị Ct được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q 2.3.1.49 (Qiagen, Đức).
2.2.8. Phân tích đột biến trên DNA bằng phương pháp ARMS
Để đánh giá khả năng phát hiện đột biến của quy trình ExBP-RT phát hiện đột biến T790M/L858R trên mRNA ở nhóm mẫu bệnh phẩm trước điều trị, bộ kit thương mại therascreen EGFR RGQ PCR Kit, Version 2 (Qiagen, Đức) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đối chiếu kết quả về khả năng phát hiện đột biến trên RNA so với DNA. Kết quả phát hiện đột biến trên DNA bằng bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit được tính toán bằng giá trị ∆Ct giữa phản ứng đột biến và phả n
ứng EGFR tổng số của cùng một mẫu.
40
Trong đó, Ctđột biến là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR đột biến; CtDNA tổng số là giá trị Ct của phản ứng qPCR khuếch đại DNA EGFR tổng số. Giá trị
Ct được xác định bằng phần mềm Rotor-Gene Q 2.3.1.49 (Qiagen, Đức).
Sau đó, so sánh với giá trị cut-off tương ứng của loại đột biến theo khuyến cáo của bộ kit để đưa ra kết quả. Giá trị cut-off này được định nghĩa là giá trị mà tại đó tín hiệu dương tính có thể phân biệt được với tín hiệu nhiễu gây ra bởi mồi ARMS trên khuôn DNA kiểu dại. Nếu giá trị ∆Ct của mẫu cao hơn giá trị cut-off, đưa ra kết luận không phát hiện đột biến trên khuôn DNA hoặc do giới hạn phát hiện của bộ kit. Ngược lại, nếu giá trị ∆Ct của đột biến nào đó của mẫu thấp hơn giá trị cut-off, kết luận mẫu dương tính với đột biến đó (Bảng 12).
Bảng 12: Giá trị cut-off của bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit phát hiện đột biến EGFR DNA
Phản ứng đột biến Giá trị cut-off
T790M 7,40
L858R 8,90
Sau khi so sánh hiệu quả phát hiện đột biến T790M/L858R trên khuôn RNA với khuôn DNA, hiệu quả phát hiện đột biến T790M mRNA trên nhóm mẫu đang điều trị đích được tiếp tục đánh giá.
2.2.9. Phân tích thống kê
Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các đặc điểm cận lâm sàng và kết quả phát hiện đột biến EGFR bằng kỹ thuật ExBP-RT dựa trên kiểm định Mann-Whitney U test hoặc Wilcoxon test. Hệ số Cohen’s Kappa được sử dụng để đánh giá về sự tương đồng kết quả phát hiện đột biến trên RNA so với kết quả phát hiện đột biến trên DNA. Phân tích thống kê được thực hiện với phần mềm SPSS 20 (IBM) và GraphPad Prism 9.0.2 (161). Giá trị p < 0,05 biểu thị mối sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Độ nhạy lâm sàng, độ đặc hiệu lâm sàng và độ chính xác lâm sàng của quy trình phát hiện đột biến được tính toán bằng phần mềm MedCalc Version 19.7.2. Độ nhạy lâm sàng được định nghĩa là khả năng xác định chính xác những bệnh nhân có bệnh của một xét nghiệm, được thể hiện qua tỷ lệ những trường hợp mắc bệnh có kết
41
quả xét nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh. Độ nhạy lâm sàng được xác định dựa trên công thức:
Độ 𝑛ℎạ𝑦 𝑙â𝑚 𝑠à𝑛𝑔 = 𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡
𝐷ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑡ℎậ𝑡 + Â𝑚 𝑡í𝑛ℎ 𝑔𝑖ả
Trong đó:
o Tổng số trường hợp dương tính thật được hiểu là tổng số xét nghiệm cho kết quả dương tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột biến trên DNA (Qiagen) cũng cho kết quả dương tính khi sử dụng quy trình phát hiện đột