Phƣơng pháp nghiên cứu

CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp tạo dịch chiết nấm mốc

Mỗi chủng nấm mốc đƣợc nuôi cấy nhân sinh khối lƣợng lớn trên môi trƣờng PDA trong bình tam giác 2L nhằm sản sinh ra lƣợng đủ lớn các hợp chất thứ cấp phục vụ cho nghiên cứu thành phần hóa học. Sinh khối nấm mốc đƣợc ngâm chiết trong dung môi EtOAc trong điều kiện siêu âm (30 phút x 3 lần) và nhiệt độ phòng. Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc và đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn chiết tổng.

2.2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

- Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, 105875).

- Sắc ký cột (CC): đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thƣờng, silica gel pha đảo ODS (30 - 50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.), Diaion HP-20, và Sephadex LH-20. - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): thực hiện trên hệ thống máy HPLC Agilent 1200.

2.2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất

- Phổ hồng ngoại (IR): đƣợc đo trên máy Nicolet 380 FT-IR spectrometer.

- Phổ tử ngoại (UV): đƣợc đo trên máy JASCO V-630 UV-VIS spectrophotometer. - Phổ khối lƣợng (MS): Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) đƣợc đo trên máy AGILENT 1200 LC-MSD Trap.

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer.

- Phổ lƣỡng sắc tròn (CD): đƣợc đo trên máy Chirascan CD spectrometer. - Độ quay cực []D:đo trên máy Jasco P-2000 digital polarimeter.

2.2.4. Phƣơng pháp tính toán phổ ECD

Tính toán phổ lƣỡng sắc hình tròn điện tử (ECD) lý thuyết với hàm mật độ phụ thuộc thời gian (TDDFT) đƣợc thực hiện bằng chƣơng trình Gaussian 16W [85]. Đầu tiên, các cấu dạng của hợp chất đƣợc phân tích bằng chƣơng trình Spartan'18 với trƣờng lực MMFF. Những cấu dạng có thông số Boltzmann trên 1% đã đƣợc lựa chọn để tính toán phổ ECD và đƣợc tối ƣu hóa với hàm chức năng B3LYP/6-311G(d,p) trong methanol bằng mô hình CPCM [86]. Phổ ECD lý thuyết đƣợc tính toán trong methanol bằng phƣơng pháp TDDFT ở cùng hàm chức năng bằng chƣơng trình Gaussian 16W. Cuối cùng, phổ ECD tính toán lý thuyết đƣợc mô hình hóa bằng chƣơng trình SpecDis 1.71 [87]. Phổ ECD tính toán cho mỗi cấu dạng đƣợc tuân theo trọng số và tính tổng theo phân bố Boltzmann và so sánh với dữ liệu thực nghiệm.

2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ

Phƣơng pháp thử độ độc tế bào ung thƣ in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ (TBUT) ở điều kiện in vitro. Phép thử này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của

Monks (1991) [88]. Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận

với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.

Phép thử đƣợc thực hiện trong điều kiện cụ thể nhƣ sau:

Pha các mẫu dịch chiết thử thành các dải nồng độ thích hợp. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 l tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ mẫu thử trong giếng là 100, 20, 4, và 0.8 g/mL đối với cặn chiết và nồng độ 100, 20, 4, và 0.8 M đối với chất sạch. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhƣng có TBUT (190l) sẽ đƣợc sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ đƣợc cố định bằng Trichloracetic acid – TCA. Sau 48 giờ, tế bào đƣợc cố định bằng TCA trong 1 giờ, đƣợc nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng. 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lƣợng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. Đọc kết quả OD ở bƣớc sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).

Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ đƣợc xác định thông qua công thức sau:

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % Ức chế = 100% -

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

Phép thử đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10

g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml đƣợc sử dụng nhƣ là chất đối chứng dƣơng; DMSO 10% luôn đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ đƣợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.2.6. Phƣơng pháp đánh giá ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO)

2.2.6.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Dòng tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

Tế bào đƣợc cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37o

2.2.6.2. Phương pháp MTT

Phƣơng pháp MTT đƣợc sử dụng để đánh giá độc tính của các hợp chất thử nghiệm đối với sự sống sót của tế bào RAW264.7 [89].

Chất thử (20 l) đƣợc đƣa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tƣơng tự nồng độ của thí nghiệm NO. Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 l tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ. Sau 72 giờ, 10 l MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) đƣợc cho vào mỗi giếng. Sau 4h, loại bỏ môi trƣờng, tinh thể formazan đƣợc hòa tan bằng 50 L (DMSO) 100%. Giá trị OD đo ở bƣớc sóng 540 nm bằng máy quang phổ.

Lƣợng tế bào sống sót sẽ đƣợc tính theo công thức:

OD (chất thử) - OD (đối chứng trắng)

% tế bào sống sót = x 100% OD (DMSO) - OD (đối chứng trắng)

2.2.6.3. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO

Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO bằng phƣơng pháp Griess [90].

Tế bào RAW 274.7 đƣợc đƣa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h. Tiếp theo, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc loại bỏ, thay bằng môi trƣờng DMEM không có FBS trong 3h. Tế bào sau đó đƣợc ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trƣớc khi đƣợc kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h. Một số giếng không đƣợc ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu đƣợc coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml.

Nitrite (NO2-), đƣợc xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ đƣợc xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trƣờng nuôi tế bào (ủ mẫu) đƣợc chuyển sang đĩa 96 mới và đƣợc thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nƣớc. Hỗn

hợp này đƣợc ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lƣợng nitrite sẽ đƣợc đo bằng máy microplate reader ở bƣớc sóng 540 nm. Môi trƣờng DMEM không FBS đƣợc sử dụng nhƣ giếng trắng (blank).

Hàm lƣợng nitrite của từng mẫu thí nghiệm đƣợc xác định nhờ vào đƣờng cong hàm lƣợng chuẩn NaNO2 và đƣợc so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu đƣợc xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lƣợng NOsample/hàm lƣợng NOLPS] x 100

Phép thử đƣợc lặp lại 3 lần. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) đƣợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.2.7. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết và các hợp chất phân lập đƣợc đánh giá đối với các vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), bao gồm ba chủng vi khuẩn Gram dƣơng (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus

ATCC25923 và Bacillus cereus ATCC13245), ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, và Salmonella enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans ATCC 24433.

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần từ 3002.34 µM với số thí nghiệm lặp lại N=3.

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×105CFU/ml.

Tiến hành thử: lấy 6 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mM vào hàng đầu tiên có chứa 100l môi trƣờng LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt đƣợc nồng độ là 2.34 M, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×105 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và đƣợc xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Streptomycin và nystatin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng [91, 92].