CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.Kết quả phân lập, làm sạch, tinh chế các hợp chất từ các chủng nấm mốc A.
niger IMBC-NMTP01
Chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 sau khi đƣợc lên men sinh khối lƣợng lớn và chiết với ethylacetate thu đƣợc 5.2 g cao chiết tổng. Cao chiết này đƣợc cắt phân đoạn qua cột pha đảo (RP) C18, rửa giải gradient lần lƣợt với các tỷ lệ dung môi tăng dần của methanol (MeOH) trong H2O từ 20:80 đến 100: 0 để thu đƣợc sáu phân đoạn F1 - F6. Phân đoạn F1 đƣợc tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 (CC), sử dụng MeOH-H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải để thu đƣợc hợp chất A14 (18 mg). Phân đoạn F2 đƣợc rửa nhiều lần bằng MeOH và lọc qua giấy lọc, thu đƣợc chất bột màu trắng (hợp chất A10, 11 mg) và ba phần nhỏ (F2.1 - F2.3). F2.1 đƣợc tách bằng silica gel CC, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (7: 1, v/v) và đƣợc tinh chế thêm qua cột RP C18 HPLC, sử dụng hệ dung môi rửa giải 11% CH3CN trong nƣớc (chứa 0,1% HCOOH) để tạo ra hợp chất A3 (2,2 mg, tR = 28,2 phút). F2.2 đƣợc đƣa vào silica gel CC, với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (7: 1, v/v) làm chất rửa giải thu đƣợc hợp chất A4 (3 mg). Phân đoạn F3 đƣợc đƣa lên cột Sephadex LH-20 CC, rửa giải
bằng MeOH-H2O (4: 1, v/v) để tạo ra sáu phần F3.1 – F3.6. F3.1 đƣợc sắc ký bằng cột silica gel, với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (8: 1, v/v) làm pha động để thu đƣợc hợp chất A5 (5 mg). F3.2 đƣợc tách bằng cột silica gel CC, sử dụng hệ n-hexan – EtOAc
(1: 2,5, v/v) làm pha động để thu đƣợc hợp chất A2 (13 mg). F3.3 đƣợc sắc ký trên
silica gel, rửa giải bằng n-hexan-EtOAc (1: 1, v/v) để thu đƣợc hợp chất A1 (2,4 mg)
và một phần nhỏ đƣợc tinh chế thêm qua cột RP C18 HPLC, sử dụng dung môi 28% CH3CN trong nƣớc (chứa 0,1% HCOOH) làm chất rửa giải để giải phóng hợp chất A11 (2 mg, tR = 28,3 phút). Từ phân đoạn F3.5, hợp chất A8 (6 mg) đƣợc phân lập bằng cột silica gel CC, rửa giải bằng CH2Cl2 – EtOAc (4: 1, v/v). Phân đoạn F4 đƣợc tách qua cột Sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi MeOH – H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải để tách thành 5 phần F4.1 – F4.5. F4.2 đƣợc sắc ký qua cột silica gel CC, rửa giải bằng CH2Cl2 – EtOAc (3,5: 1, v/v) và đƣợc tinh chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa giải 36% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu đƣợc hợp chất A12 (4 mg, tR = 17,0 phút). F4.3 đƣợc tách bằng silica gel CC, rửa giải với CH2Cl2 – acetone (8: 1, v/v) để thu đƣợc hợp chất A7 (16 mg) và một phân đoạn nhỏ đƣợc tinh chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng 33% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) làm chất rửa giải để thu đƣợc hợp chất A9 (2,3 mg, tR = 28,7 phút). F4.4 đƣợc đƣa qua cột RP C18 CC, rửa giải bằng CH3CN – H2O (1: 1, v/v) để tạo ra các phân đoạn con F4.4.1 – F4.4.4. F4.4.1 đƣợc tinh chế qua RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa
giải 47% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu đƣợc hợp chất A6 (6 mg, tR = 31,8 phút). Tƣơng tự, hợp chất A13 (5 mg, tR = 30,6 phút) thu đƣợc từ phân đoạn F4.4.4 bằng cách chuẩn bị RP C18 HPLC, sử dụng hệ dung môi 45% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH). Nhƣ vậy, từ cao chiết tổng của chủng A. niger IMBC- NMTP01, sử dụng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp, kết quả thu đƣợc 14 hợp chất sạch (Hình 3.3).
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01