* Tình hình nghiên cứu trong nước
Polyphenols ở thực vật trên cạn như: trà xanh, lá tràm…cũng như thực vật biển (rong biển) đã được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam. Năm 2011, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa hóa học của hợp chất polyphenol nhóm Tannin từ vỏ keo lá tràm”. Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm có nhiều nghiên cứu polyphenol từ lá chè như: TS. Vũ Hồng Sơn và Hà Duyên Tư của Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm thực hiện một số nghiên cứu về polyphenol như: “Khảo sát hàm lượng polyphenol trong một số giống chè vùng trung du và miền núi các tỉnh phía Bắc thu hái vào vụ đông” (2008), “Nghiên cứu quá trình trích ly polyphenol từ chè xanh vụn” (2009) [46].
Từ năm 2009 đến nay Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã nghiên cứu và công bố khoảng 50 bài, 2 cuốn sách chuyên khảo và 2
patent về hàm lượng và hoạt tính sinh học của polyphenol có nguồn gốc từ thực vật Việt Nam. Năm 2012, ThS. Đặng Xuân Cường đã thực hiện đề tài độc lập cấp tỉnh Khánh Hòa “Xây dựng quy trình chiết xuất, sản xuất đồ uống giàu polyphenol, chlorophyll từ cây ngô” [7]. Hiện nay, trên thị trường có một số sản phẩm chứa polyphenol [45] như sau:
Hình 1.4. Một số sản phẩm chứa polyphenol trong nước
1.3. CHLOROPHYLL
1.3.1. Đặc tính của chlorophyll
Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll) là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam. Lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc vào lượng sinh khối [47]. Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng. Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng. Do đó, màu các mô chứa chlorophyll có màu xanh lá cây [48].
Hình 1.5. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển Chlorophyll được biết đến như một phụ gia thực phẩm (chất nhuộm màu) Chlorophyll được biết đến như một phụ gia thực phẩm (chất nhuộm màu) và mã số trong danh mục chất phụ gia thực phẩm là E140. Các đầu bếp sử dụng chlorophyll để tạo màu sắc đa dạng cho thực phẩm và các loại đồ uống có màu xanh lá cây như mì ống và absinthe [49]. Chlorophyll không tan trong nước nhưng tan trong dung môi dầu. Chiết xuất chlorophyll lỏng được coi là không ổn định và luôn luôn biến đổi cho đến năm 1997, khi Frank S.& Lisa Sagliano
sử dụng việc làm đông khô chlorophyll lỏng tại trường đại học tại Florida và được giữ ổn định ở dạng bột, bảo quản và để sử dụng trong tương lai.
1.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng được biết đến là các chất có hoạt động chống oxy hóa. Việc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của chúng, như chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thư. Vì vậy, việc áp dụng một chế độ ăn uống giàu chlorophyll có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn sự khởi đầu của một số bệnh như ung thư, đó là các biểu hiện lão hóa được gây ra bởi các gốc tự do. Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng, các dẫn xuất của chlorophyll, như chlorophyllin, đã cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là như vitamin C. Các chức năng của chlorophyll đối với động vật được biết đến là giúp ức chế quá trình peoroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi sự hư hại gây ra bởi các gốc tự do khác nhau và các loại phản ứng oxy hóa khác. Chlorophyllin cũng được báo cáo là giúp ngăn chặn các bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể. Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được đánh giá. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng khả năng của mỗi hợp chất sau đây trong việc nhặt gốc tự do như 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6sulfonate) (ABTS+). Hoạt động Antimutagenic đã được khảo nghiệm với một chủng vi khuẩn vi hình gây đột biến đảo ngược, bằng cách sử dụng vi khuẩn Salmonella typhimurium
TA100 và benzo[a]pyrene như một chủng thử nghiệm và gây đột biến tương ứng. Các chất dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b. Hơn nữa, các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll như chlorins, pheophytins, và pyropheophytins cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim loại như Mg- chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytina, and Cu- chlorophyllins. Những kết quả này đã chứng minh rằng các dẫn xuất của chlorophyll trong chế độ ăn uống ở cả hai loại thực phẩm tươi và thực phẩm chế biến, chế độ ăn uống bổ sung có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic [50].
Nghiên cứu về chlorophyll từ bột vi khuẩn lam (Spirulina sp.) đã được thực hiện để xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái và suy thoái động học của chlorophyll a và chiết xuất thô, cũng như điều tra sự khác biệt của hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll khi có chiếu xạ hoặc không có chiếu xạ. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chlorophyll a được tăng lên sau 60 phút chiếu xạ [51].
Hoạt động của chất chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh hoặc trà có nguồn gốc polyphenol đã được nghiên cứu rộng rãi. Khi tập trung các phần không chứa polyphenol, chúng được phát hiện là chlorophyll a và b, pheophytins a và b, carotenoid, như beta-carotene và lutein. Mặc dù tất cả các sắc tố đều biểu hiện hoạt động của các chất chống oxy hóa quan trọng, mức độ của hoạt động ức chế chống lại hydroperoxide của chlorophyll a> lutein> pheophytin a> chlorophyll b> beta-carotene > pheophytin b. Những kết quả này cho thấy, phần phi polyphenol (chlorophyll a và b, pheophytins a và b, beta-carotene và lutein) trong trà xanh có hoạt tính ức chế mạnh chống lại hệ hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic [52].
1.3.3. Tác dụng của chlorophyll
Như thuốc thay thế, chất diệp lục có tác dụng tích cực đối với tình trạng kháng viêm, quá trình oxy hóa và chữa lành vết thương. Chlorophyll và chlorophyllin (dẫn xuất của chlorophyll) có thể hình thành cấu trúc phức hợp với một số hóa chất gây ung thư như: aflatoxin B1 (trong bột), chất chiết xuất từ nhiều loại gia vị, thảo mộc và thực vật bậc cao hoặc một số các amin dị vòng (trong thịt nấu chín) hoặc các hydrocarbon thơm mạch vòng (trong khói thuốc lá). Sự hình thành các cấu trúc phức hợp này có thể giảm thiểu khả năng gây ung thư, tăng quá trình đào thải chất độc ở đường tiêu hóa và số lượng các chất gây ung thư trong các mô nhạy cảm có thể bị giảm [53], sửa chữa các tế bào, tăng hemoglobin trong máu và thúc đẩy sự tăng trưởng tế bào.
Khả năng phòng ngừa ung thư của các dẫn xuất Chlorophyll đã được thực hiện [54]. Hoshina và cộng sự (1998) và Sato và cộng sự (1986) đã chứng minh, chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có đặc tính chống oxy hóa. Đặc tính chống oxy hóa của Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng phụ thuộc vào
sự hiện diện của ánh sáng. Chlorophyll được coi là siêu thực phẩm bởi đặc tính chống oxy hóa mạnh và giá trị dinh dưỡng của chúng. Chúng bảo vệ tế bào khỏi sự oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc tự do [55]. Dịch chiết của Conyza
triloba trong dung môi methanol và nước có hàm lượng Chl, hoạt tính bắt gốc
tự do hoạt tính tạo phức với kim loại cao và tương đương với Trolox. Mặt khác, bằng xét nghiệm DPPH, dịch chiết của Conyza triloba có hoạt tính bắt gốc tự do tốt hơn α –tocopherol [54].
Hoạt tính chống oxy hóa của 6 dẫn xuất Chlorophyll tự nhiên trong dịch chiết và Cu-Chlorophyllin được nghiên cứu bằng cách đo độ tác dụng bảo vệ của chúng chống lại quá trình oxy hóa lipid. Đối với điều này, phương pháp khử các β-carotene và thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do (DPPH) được sử dụng. Các kết quả thu được theo phương pháp khử β-carotene cho thấy rằng tất cả các dẫn xuất của Chlorophyll được thể hiện của phản ứng phụ thuộc vào liều lượng. Pheophorbide b, phaeophytin b là các hợp chất chống oxy hóa tự nhiên mạnh nhất, các hoạt tính này có thể so sánh với butylated hydroxyl toluene (BHT). Hoạt tính chống oxy hóa của pheophorbide b là cao hơn so với pheophorbide a, điều này chứng minh tầm quan trọng cho các chức năng của nhóm aldehyde trong cấu trúc. Đối với Copper - Chlorophyllin, Shanab đã thử nghiệm ở cả hai phương pháp, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của Cu– Chlorophyllin cao hơn so với chlorophyll tự nhiên, đồng thời chỉ ra bản chất tạo phức giữa kim loại với vòng porphyrin. Cơ chế của hoạt tính chống oxy hóa của Chlorophyll tự nhiên và dẫn xuất của chúng không dựa vào khả năng đóng góp hydro, nhưng chúng có thể ức chế quá trình oxy hóa acid linoleic và/hoặc ngăn ngừa quá trình phá hủy tế bào bởi hydroperoxides. Về mặt độc tính tế bào của các dẫn xuất Chlorophyll, pheophorbide hấp thu tế bào và ức chế đa số tế bào bệnh u tủy tốt hơn phaeophytin. Do đó, các dẫn xuất của Chlorophyll có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng chống ung thư [50]. Chlorophyllin có thể ức chế phát triển của calcium oxalate dihydrate - nhân tố cơ bản hình thành sỏi calcium oxalate (gây sỏi thận). Maekawa chỉ ra hiệu quả kháng khuẩn của trà xanh, Chlorophyll và Na-Cu chlorophyll trên vi khuẩn đường miệng (Porphyromonas gingivalis và Fusobacterium nucleatum) phụ thuộc vào mỗi cá thể. Chlorophyllin đồng không thể hiện hoạt tính ức chế các
vi khuẩn này. Bệnh nhân bị tái phát viêm tụy mạn tính có thể được điều trị bằng Chlorophyll a mà không có bất kỳ tác dụng phụ bất lợi, chẳng hạn như các phản ứng dị ứng, hoặc cảm quang, hoặc gây độc cho gan. Ngoài ra, chlorophyll còn có nhiều tác dụng trong y học:
+ Giúp cải thiện tính năng tinh lọc máu tự nhiên của cơ thể; + Chống thiếu máu, vi chất trong quá trình tạo hemoglobin; + Tăng số tế bào hồng cầu, làm các tế bào mạnh thêm; + Tăng lượng máu;
+ Tăng cường các phản ứng miễn dịch chủ yếu trong cơ thể; + Chống lại các chất độc tố/ Chống lại chất gây ung thư; + Giúp cơ thể thải loại các chất cặn bã;
+ Ngăn ngừa sự suy hô hấp; + Làm dịu thấp khớp;
+ Giúp phòng chống các bệnh tim mạch, các dấu hiệu sớm tuổi già; + Tăng cường chức năng thận và bàng quan;
+ Giảm giãn tĩnh mạch;
+ Tăng cường chức năng tiêu hoá;
+ Chống táo bón bằng việc tăng cường sự lưu thông của đường mật; + Cải thiện tình trang đái tháo đường;
+ Chống các bệnh về tuyến giáp;
+ Tăng cường chức năng gan và cải thiện vấn đề gan; + Giảm chóng mặt;
+ Chống mất ngủ; + Giảm thiếu máu não;
+ Chống mùi hôi thối, mùi hôi cũng như mùi cơ thể là do các muối magiê của chúng [56].
Ngoài ra, các dẫn xuất của Chlorophyll được sử dụng trong sản xuất xà phòng, dầu gội và kem đánh răng, nước súc miệng và trong và khử mùi cũng như trong băng phẫu thuật, băng và thuốc mỡ khử trùng [57]. Chlorophyll là nguồn tiềm năng của các sắc tố trong mỹ phẩm; tảo nâu và đỏ được sử dụng chủ yếu trong ngành công nghiệp mỹ phẩm [58].
Mặc dù, chlorophyll là chất màu thực phẩm tự nhiên, nhưng hàm lượng của chúng không được biết đến chính xác và có xu hướng không ổn định trong điều kiện pH khác nhau của các loại thực phẩm. Chúng đắt hơn các chất tạo màu nhân tạo và phải trải qua quá trình biến đổi hóa học bằng cách thay thế các trung tâm Mg2+ với ion Cu2+ hoặc Zn2+ để cải thiện sự ổn định của chúng. Phức hợp đồng không bị hấp thụ bởi cơ thể và bị loại bỏ hoàn toàn trong quá trình bài tiết, nên chúng được coi là an toàn và được phép sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới như phụ gia thực phẩm [59].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chlorophyll
* Thế giới
Năm 1771, Joseph đã khám phá cơ bản về quá trình quang hợp ở Anh. Năm 1800, Jean Senebier công bố bộ chuyên khảo của mình "Le physiologie vegètale," về nghiên cứu quang hợp được coi là một phần của sinh lý thực vật. Năm 1817, lần đầu tiên các nhà khoa học người Pháp Pellitier và Caventou đã chiết sắc tố từ lá cây bằng cồn với nước sôi và cũng đã biết về thành phần và vai trò sinh học của Chlorophyll. Tại thời điểm đó, các nhà khoa học cho biết rằng cây xanh tiêu thụ carbon dioxide và giải phóng lượng và oxy [60].
Năm 1883, nhà sinh lý học người Đức - Julius von Sachs cho thấy, chất diệp lục được tìm thấy trong các cấu trúc đặc biệt gọi là lục lạp của thực vật. Ông đã chứng minh được chất diệp lục có liên quan tới quang hợp. Nhiều nghiên cứu sau này chỉ ra, chất diệp lục là chất hóa học cần thiết cho quá trình quang hợp [60]. Chlorophyll a và b đã được tinh chế bởi nhà khoa học người Đức, Richard Willstatter trong thời gian 1906-1914. Willstatter nhận được giải Nobel Hóa học năm 1915 cho công trình “Cấu tạo hóa học của hồng cầu gần như đồng nhất với chlorophyll giúp tăng cường hồng cầu” [60].
Năm 1930, Hans Fischer đã nhận giải Nobel hóa học với công trình nghiên cứu “Chlorophyll giúp thải lọc độc tố khỏi cơ thể” [60].
Năm 1965, một nhà khoa học Mỹ là Robert Burns Woodward đã giành giải thưởng cao quý trong Hóa học về việc tìm ra cấu trúc của các phân tử chất diệp lục.
Năm 1966, nhà khoa học người Mỹ, Everett M. Burdick đã phát minh ra phương pháp phục hồi Chlorophyll từ cây đu đủ.
Từ năm 1978 trở đi, với nhiều công trình nghiên cứu khác nhau, các nhà khoa học đã chiết xuất và định lượng được Chlorophyll từ nhiều loài thực vật khác nhau trong các loại dung môi khác nhau. Cụ thể, Moed và Hallegraeff (1978), Nusch (1980), Arvola (1981), Sartory và Grobbelaar (1984), hay Lichtenthaler K. H. và cộng sự (1987, 1989) đã chỉ ra các phương pháp định lượng Chlorophyll trong các dung môi khác nhau như acetone, ethanol, methanol, dimethyl formamide, dimethyl sulfoxde [60].
Việc tìm ra các đặc tính sinh học và lợi ích của Chlorophyll với sức khỏe con người đã được các nhà sản xuất lớn trên thế giới quan tâm và đã sản xuất các dòng sản phẩm nhằm mang lại sức khỏe tốt cho con người từ thực vật. Tuy nhiên, các sản phẩm về Chlorophyll chủ yếu ở dạng dịch lỏng cô đặc khó bảo quản. Công ty của Mỹ đã ứng dụng công nghệ cao mới sản xuất được chế phẩm Chlorophyllin, nhưng giá thành rất cao [60].
Hiện nay, trên thế giới mới nghiên cứu về mối tương quan giữa điều kiện tự nhiên, phân bón với hàm lượng Chlorophyll từ cây ngô. Chiết tách, tinh chế để tạo ra sản phẩm từ Chlorophyll cây ngô để ứng dụng trong thực phẩm vẫn chưa được công bố. Một số sản phẩm chứa hoạt chất Chlorophyll trên thị trường hiện nay:
Chlorophyll Fibersol Plus:
Diệp lục trong sản phẩm Chlorophyll Fibersol Plus được lấy từ cỏ linh lăng. Trong tiếng Arab cỏ linh lăng nghĩa là "cha của thực phẩm", vì chúng tốt cho sức khỏe và 01 gói tương đương dinh dưỡng chứa trong 01 kg rau xanh. Cỏ linh lăng chứa hàm lượng diệp lục cao gấp 4 lần so với các loại rau thông
thường, do vậy đây là thực phẩm tự nhiên tuyệt vời để cải thiện sức khoẻ con người.
Hình 1.6. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường Chiết xuất diệp lục (Liquid chlorophyll- synerry): Chiết xuất diệp lục (Liquid chlorophyll- synerry):
Sản phẩm được nghiên cứu và sản xuất tại Mỹ. Tập đoàn Synergy - Nature's Sunshine là nhà nhập khẩu cỏ Linh Lăng lớn nhất toàn cầu. Tập đoàn sử dụng cỏ Linh Lăng để chiết xuất ra chất diệp lục. Sản phẩm của tập đoàn chứa 8 loại Enzym cơ bản ở dạng tự nhiên, các vi lượng và khoáng chất, hoàn toàn không có hoá chất, chất bảo quản và độc tố gây hại cho cơ thể người.
* Trong nước
Việc sử dụng Chlorophyll từ lá cây làm màu trong thực phẩm đã được