TT Lô thử nghiệm Số chuột Thực nghiệm
1 Sinh lý trước thí nghiệm
10 (5 đực, 5 cái)
Nuôi ổn định 5 ngày, giết mổ, khảo sát các chỉ số của chuột trước thử nghiệm
2 Sinh lý sau 14 ngày (SL14)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống nước cất, liều 10 ml/kg/ngày trong 14 ngày liên tục
3
Mẫu thử liều 1 viên/kg sau 14 ngày (Thử 1a)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống mẫu thử liều 1 viên/kg trong 14 ngày liên tục
4
Mẫu thử liều 3 viên/kg sau 14 ngày (Thử 2a)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống mẫu thử liều 3 viên/kg trong 14 ngày liên tục
5 Sinh lý sau 28 ngày (SL28)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống nước cất, liều 10 ml/kg/ngày trong 28 ngày liên tục
6
Mẫu thử liều 1 viên/kg sau 28 ngày (Thử 1b)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống mẫu thử liều 1 viên/kg trong 28 ngày liên tục
7
Mẫu thử liều 3 viên/kg sau 28 ngày (Thử 2b)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống mẫu thử liều 3 viên/kg trong 28 ngày liên tục
Cho chuột uống nước cất hoặc mẫu thử mỗi ngày, 01 lần/ngày vào buổi sáng (8 - 10 giờ sáng) liên tục trong 14 ngày (lô SL14, Thử 1a, Thử 2a) hoặc 28 ngày (lô SL28, Thử 1b, Thử 2b), thể tích cho uống 10 ml/kg.
Theo dõi chuột trong quá trình thử nghiệm về: hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật…); lông (mượt, dựng đứng, rụng…) và các cơ quan: mắt, mũi…; tình trạng ăn, uống; tính chất phân, nước tiểu, trọng lượng. Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của chuột được ghi nhận bằng cách cân chuột 1 lần/tuần.
Sau 14 hoặc 28 ngày, chuột được gây mê bằng đá CO2, mổ nhanh để lấy máu tim thực hiện xét nghiệm các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu (RBC), bạch cầu (WBC), tiểu cầu (PLT), huyết sắc tố hemoglobin (HGB), dung tích hồng cầu hematocrit (HCT), thể tích trung bình một hồng cầu (MCV), số lượng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH), nồng độ hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCHC) và khoảng phân bố hồng cầu (RDW) (kiểm tra chức năng tạo máu); kiểm tra chức năng gan [aspartat aminotransferase (AST), alanin amino-transferase (ALT), protein toàn phần, bilirubin toàn phần, cholesterol); kiểm tra chức năng thận (ure, creatinin) bằng máy xét nghiệm sinh hóa tự động tại Phòng khám Đa khoa Medlatec, 98 Thích Quảng Đức, Phường 5, Q. Phú Nhuận, TP. Hồ Chí Minh.
Vào ngày 28, quan sát đại thể, ghi nhận màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương,... các cơ quan tim, gan, thận, phổi, dạ dày, ruột,... Tách lấy gan và thận, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh. Thấm khô. Cho gan, thận vào formol 10%. Lấy ngẫu nhiên 6 mẫu gan, thận trong 1 lô để phân tích vi thể sau khi nhuộm hematoxylin-eosin (HE) bằng kính hiển vi quang học (Labomed, Hoa Kỳ) tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh. Mức độ viêm, tổn thương gan được đánh giá theo thang điểm HAI-Knodell với thang điểm 18 dựa trên mức độ hoại tử quanh khoảng cửa (0-4 điểm); hoại tử quanh
tĩnh mạch trung tâm (0-6 điểm); hoại tử trong tiểu thùy (0-4 điểm); viêm quanh khoảng cửa (0-4 điểm). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiêu chí đánh giá
Tình trạng chung, các chỉ số công thức máu, chức năng gan, thận của lô uống mẫu thử khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý ở cùng thời điểm khảo sát sau 14 và 28 ngày chứng tỏ việc uống mẫu thử không làm thay đổi tình trạng chung cũng như chức năng tạo máu, chức năng gan, thận của chuột thử nghiệm.
2.2.5. Xử lý kết quả và phân tích thống kê
Kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± SEM (standard error of mean - sai số chuẩn của số trung bình). Sự khác biệt giữa các lô được phân tích bằng phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-Whitney với phần mềm SPSS 22.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA VIÊN HOÀN
Viên hoàn được tạo thành có hàm lượng polyphenol tương ứng 32,03 ±1,34 mg axit gallic.
Hoạt tính chống oxy hóa tổng, khử sắt và bắt gốc tự do DPPH của viên hoàn là 148,81 ±6,56 mg axit ascorbic, 168,08 ±7,14 mg FeSO4 và 76,97 ±1,65 %.
Hoạt tính ức chế quá trình hình thành diene liên hợp, hoạt tính enzyme catalase và hoạt tính lipoprotein mật độ thấp được xác định 0,65 mg/mL, 0,323 U/mL và 0,218 µM/g.
Trong viên hoàn cũng chứa 109,87 ±2,69 µg chlorophyll, 20,48 ±0,57 mg axit ascorbic (vitamin C), 20,28 ±0,51 mg axit uronic (sodium alginate) và tá dược. Alginate được nghiên cứu chiết và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cũng như đặc tính vật lý cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa của sodium alginate làm sạch là 188,54 mg axit ascorbic/g DW và khối lượng phân tử là 78,6 kD. Tuy nhiên, trong khi sử dụng alginate trong viên hoàn, hoạt tính chống oxy hóa không cao được như khi chúng đơn lẻ, có thể do trong viên hoàn có các polysaccharide khác giảm hoạt tính chống oxy hóa của alginate.
Hoạt tính chống oxy hóa được phân tích bằng phương pháp chuyển hóa Mo6+ thành Mo5+, Fe3+ thành Fe2+ và bắt gốc tự do DPPH độ chính xác hoàn toàn tin cậy không cần kiểm chứng.
Tuy nhiên, đối với phương pháp hoạt tính ức chế quá trình hình thành diene liên hợp, hoạt tính enzyme catalase và hoạt tính lipoprotein mật độ thấp nên được tiếp tục nghiên cứu, đánh giá và phân tích, bởi điều kiện bảo quản hóa chất phục vụ những phân tích này rất nghiêm ngặt. Hầu hết yêu cầu bảo quản ở nhiệt độ âm, nên quá trình vận chuyển thương mại hóa chất không đạt được nhiệt độ như yêu cầu của nhà sản xuất. Vì vậy, kết quả hoạt tính ức chế quá trình hình thành diene liên hợp, hoạt tính enzyme catalase và hoạt tính lipoprotein mật độ thấp thấp hơn so với các công bố về các loại thực vật hoặc thực phẩm khác [76].
Hoạt tính chống oxy hóa của viên hoàn phụ thuộc lớn vào loại cơ chất sử dụng làm tá dược sản xuất viên hoàn. Đối với, các loại tá dược như dextrin và saccharose, viên hoàn tan hoàn toàn trong vòng 1 giờ; tuy nhiên, khi sử dụng tá dược carboxymethyl cellulose, hoạt tính chống oxy hóa được giải phóng chậm hơn. Nồng độ carboxymethyl cellulose tăng, khả năng giải phóng hoạt chất giảm và hoạt tính chống oxy hóa giảm trong thời gian 4 giờ; khả năng giải phóng giảm do viên hoàn trương nở và kém tan, thời gian bán rã và tan rã kéo dài hơn 4 giờ. Bảng 3.1 thể hiện khả năng giải phóng hoạt tính chống oxy hóa của viên hoàn trong khi hàm lượng carboxymethyl cellulose tăng từ 20 % đến 40 %.
Bảng 3.1. Khả năng giải phóng hoạt tính chống oxy hóa của viên hoàn sử dụng tá chất carboxymethyl cellulose sau 4 giờ
Hàm mục tiêu Thông số ban đầu Carboxymethyl cellulose (%) 20 25 30 35 40 Hoạt tính chống oxy hóa tổng 148,81 ±6,56 138,89 ±2,66 130,72 ±4,74 121,33 ±7,13 106,90± 2,13 46,56 ±1,42 Hoạt tính khử sắt 168,08 ±7,14 155,45 ±4,68 145,05 ±7,5 136,25 ±4,07 120,75± 2,87 52,57 ±1,76 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 76,97 ±1,65 71,5 ±2,88 67,82 ±5,18 62,26 ±3,51 55,33 ±1,53 24,31 ±1,48 Hàm lượng polyphenol 31,57 ±0,45 29,29 ±0,53 27,75 ±0,76 25,56 ±0,93 22,7 ±0,93 9,84 ±0,53 Hàm lượng chlorophyll 0,11 ±0,000 0,10 ±0,005 0,10 ±0,005 0,09 ±0,004 0,08 ±0,005 0,03 ±0,002 Hàm lượng alginate 21,97 ±0,07 20,41 ±0,09 19,36 ±0,12 17,78 ±0,32 15,81 ±0,71 6,88 ±0,16 Hàm lượng vitamin C 22,00 ±0,06 20,46 ±0,14 19,35 ±0,49 17,79 ±0,35 15,82 ±0,52 6,92 ±0,22
3.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH VẬT LÝ CỦA VIÊN HOÀN
3.2.1. Đặc tính cảm quan
Tổng điểm cảm quan của các viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau bị ảnh hưởng vào đặc tính cấu trúc của carbohydrate sử dụng. Carbohydate mạch thẳng, dài, nhiều nhóm methoxyl tạo kết cấu viên hoàn kém hơn so với carbohydrate mạch ngắn. Tuy nhiên, carbohydrate mạch ngắn và carbohydrate mạch thẳng có nhiều nhóm methoxyl không tạo ra viên hoàn có kết cấu tốt bằng carbohydrate mạch dài và nhiều nhóm hydroxyl.
Loại carbohydrate và hàm lượng carbohydrate sử dụng trong sản xuất viên hoàn ảnh hưởng lên tổng điểm cảm quan của viên hoàn (p<0.05). Tổng điểm cảm quan của viên hoàn tỷ lệ thuận với hàm lượng tá dược carbohydrate. Tổng điểm cảm quan tăng khi hàm lượng carbohydrate tăng và dao động trong khoảng 14,5 cho đến 19,5 điểm. Viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose, dextrin và đường mía có tổng điểm cảm quan khác nhau và tăng dần tương ứng 15,50, 16,7 và 17,9 điểm. Tổng điểm cảm quan của viên hoàn được phân làm 3 nhóm tương ứng với khoảng điểm cảm quan 16-17 điểm (nhóm 1 (carboxymethyl cellulose)), 17-18 điểm nhóm 2 (dextrin) và 18-20 điểm (nhóm 3 (đường mía)) (Hình 3.1 đến 3.4). Trong quá trình sản xuất viên hoàn, đường mía được đánh giá cao hơn so với dextrin và carboxymethyl cellulose, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu và sản xuất trong đông y về viên hoàn, như viên hoàn nghệ, viên hoàn tam thất.
Hình 3.1. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ dextrin khác nhau
Hình 3.2. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ carboxymethyl cellulose khác nhau
Hình 3.3. Điểm cảm quan của viên hoàn sử dụng nồng độ đường mía khác nhau
Hình 3.4. Điểm cảm quan bình quân của viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau
3.2.2. Đặc tính trương nở
Loại carbohydrate và hàm lượng carbohydrate tác động lên độ trương nở của viên hoàn (p<0,05), điều này được thể hiện khi phân tích ANOVA. Sự khác biệt này có thể phụ thuộc rất lớn vào cấu trúc của carbohydrate, cụ thể: đường mía (C12H22O11) được cấu tạo bởi glucose và fructose với sự kết thúc chuỗi bằng "oside" và còn được biết đến với tên gọi α-D-glucopyranozyl-(1→2)-β- D-fructofuranoside. Carboxymethyl cellulose là dẫn xuất của cellulose có các nhóm carboxymethyl (-CH2COOH) liên kết với một số nhóm hydroxyl của glucopyranose monomer. Dextrin là carbohydrate trọng lượng phân tử thấp - sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột hoặc glycogen với các đơn vị D- glucose và liên kết glycosidic α-(1 → 4) hoặc α-(1 → 6) [77,78,79]. Kết quả thực nghiệm chỉ rõ điều này, viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch dài sẽ có độ trương nở tốt hơn so với viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch ngắn.
Độ trương nở của viên hoàn thay đổi khi sử dụng các loại carbohydrate khác nhau, kết quả cho thấy độ trương nở của viên hoàn dao dộng từ 127,67 ±7,51 tới 290,00 ±8,16 %, khi so sánh với kích thước ban đầu của viên hoàn sử dụng cùng loại carbohydrate. Độ trương nở của viên hoàn tỷ lệ thuận với hàm lượng carbohydrate sử dụng. Viên hoàn có độ trương nở là 176,67 ±5,77, 290,00 ±8,16 và 180,00 ±10,00 % so với ban đầu, tương ứng với viên hoàn chứa dextrin, carboxymethyl cellulose và đường mía. Độ trương nở của viên hoàn được sắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau: dextrin, đường mía và carboxymethyl cellulose (Hình 3.5 đến 3.8). Viên hoàn có độ trương nở bình quân là 154, 186 và 232 % so với viên hoàn ban đầu, tương ứng với dextrin, đường mía và carboxymethyl cellulose.
Như vậy, độ trương nở viên hoàn sử dụng dextrin ở hàm lượng 20 % là thấp nhất và độ trương nở cao nhất là viên hoàn sử dụng carboxymethyl cellulose ở hàm lượng 40 %.
Hình 3.5. Độ trương nở của viên hoàn chứa dextrin nồng độ khác nhau
Hình 3.6. Độ trương nở của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose nồng độ khác nhau
Hình 3.7. Độ trương nở của viên hoàn chứa đường mía nồng độ khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.8. Độ trương nở bình quân của viên hoàn chứa carbohydrate khác nhau
3.2.3. Đặc tính bán rã
Trong nghiên cứu, khi phân tích cấu trúc carbohydrate sử dụng làm tá dược sản xuất viên hoàn, khả năng nhũ hóa và ổn định cấu trúc của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose cao hơn so với viên hoàn sử dụng carbohydrate mạch ngắn. Thời gian hàm lượng hoạt chất viên hoàn giảm một nửa so với ban đầu được xác định là thời gian bán rã (Khả năng bán rã) của viên hoàn, phân tích thông số này sẽ hữu ích cho quá trình kiểm soát sự hấp thụ và chuyển hóa khác nhau trong cơ thể [80]. Viên hoàn trong nghiên cứu này xảy ra quá trình đa phân rã vì chứa nhiều hoạt chất sinh học khác nhau.
Loại carbohydrate sử dụng làm tá dược ảnh hưởng lên khả năng bán rã của viên hoàn (p<0,05) và điều này cũng được tìm thấy ở hàm lượng carbohydrate sử dụng trong viên hoàn (p<0,05). Viên hoàn nhận khả năng bán rã cao nhất và thấp nhất tương ứng 14,67 ±1,53 và 206,00 ±5,29 khi sử dụng dextrin 20 % và carboxymethyl cellulose 40 %. Khả năng bán rã bình quân của viên hoàn được sắp xếp theo thứ tự giảm dần dextrin, đường mía, carboxymethyl cellulose, tương ứng thời gian 20,07, 28,47 và 163,73 phút. Hàm lượng carbohydrate sử dụng trong viên hoàn tỷ lệ nghịch với khả năng bán rã theo mô hình tuyến tính. Khoảng khả năng bán rã (thời gian bán rã tính theo phút) của viên hoàn là 14,67-27,00, 125,67-206,00 và 17,67-38,67 phút, tương ứng khi viên hoàn chứa dextrin, carboxymethyl cellulose và đường mía (Hình 3.9 đến 3.12). Khả năng tạo kết cấu của viên hoàn khi sử dụng các carbohydrate khác nhau liên quan mật thiết đến khả năng bán rã của chúng, điều này được minh chứng cụ thể thông qua sự bán rã của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose thấp nhất (125,67 ±3,21 phút), dextrin (27,00 ±1,00 phút) và đường mía (38,67 ±1,53 phút).
Hình 3.9. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa dextrin nồng độ khác nhau
Hình 3.10. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa carboxymethyl cellulose nồng độ khác nhau
Hình 3.11. Khả năng bán rã của viên hoàn chứa đường mía nồng độ khác nhau
Hình 3.12. Khả năng bán rã bình quân của viên hoàn chứa carbohydrate nồng độ khác nhau
3.2.4. Mật độ khối lượng của viên hoàn
Mối tương quan chặt chẽ giữa mật độ khối lượng viên hoàn với số lượng và khối lượng viên hoàn được xác định là trên 10 cm3. Độ nén, độ chắc, độ rỗng của viên hoàn và độ đồng đều về kích thước của viên hoàn ảnh hưởng lên số lượng và khối lượng viên hoàn trên 10 cm3. Độ rỗng khối viên hoàn càng lớn, độ đồng đều về kích thước và hình dáng viên hoàn không cao, số lượng viên hoàn trong 10 cm3 càng giảm. Mật độ khối lượng viên hoàn nhỏ khi độ nén và độ chắc của viên hoàn thấp. Thể tích chiếm chỗ của viên hoàn trong hộp/lọ thuốc được tính toán dựa trên mật độ khối lượng viên hoàn, điều này cũng góp phần lớn vào tính toán thể tích hộp/lọ đựng viên hoàn [81,82].
Hàm lượng và loại carbohydrate bổ sung trong viên hoàn tác động lên mật độ khối lượng viên hoàn (p<0,05) và dao động trong khoảng 0,54 ±0,01 tới 0,68 ±0,01 g/cm3. Sự gia tăng hàm lượng carbohydrate tỷ lệ thuận với mật độ khối lượng viên hoàn và mật độ viên hoàn biến đổi theo mô hình tuyến tính. Viên hoàn sử dụng carbohydrate khác nhau có khoảng mật độ khối lượng biến đổi theo thứ tự giảm dần 0,61 ±0,00 - 0,68 ±0,01 (carboxymethyl cellulose), 0,57 ±0,01 - 0,64 ±0,01 g/cm3 (dextrin) và 0,54 ±0,01 - 0,63 ±0,01 (đường mía), khi giảm hàm lượng carbohydrate từ 40 đến 20 % (Hình 3.13 đến 3.16). Hàm lượng carbohydrate trong viên hoàn khi thay đổi dẫn tới bình quân mật độ khối lượng viên hoàn được phân làm 2 nhóm chính theo thứ tự tăng dần, cụ thể: 0,58 – 0,6 g/cm3 (đường mía và dextrin) và 0,62 – 0,64 (carboxymethyl cellulose).
Hình 3.13. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ dextrin khác nhau
Hình 3.14. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ carboxymethyl cellulose khác nhau
Hình 3.15. Mật độ khối lượng của viên hoàn sử dụng nồng độ đường mía khác nhau
Hình 3.16. Mật độ khối lượng của viên hoàn hoàn chứa carbohydrate nồng độ khác nhau
3.2.5. Độ đồng đều khối lượng của viên hoàn
Độ đồng đều về kích thước và phân bố đều các chất cấu trúc lên viên hoàn được đánh giá dựa trên độ đồng nhất khối lượng. Độ chính xác trong quá trình sản xuất viên hoàn được đánh giá dựa vào độ đồng nhất khối lượng viên hoàn [83].
Độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn khác nhau khi sử dụng loại carbohydrate khác nhau và ở các hàm lượng khác nhau. Biên độ dao động của độ đồng nhất khối lượng viên hoàn giữa các lần đo trong cùng điều kiện về loại và hàm lượng carbohydrate luôn nhỏ hơn 12%, khi so sánh với trung bình giữa các lần đo. Tính toán độ đồng nhất khối lượng dựa trên khối lượng bình quân của viên hoàn được xắp xếp theo thứ tự giảm dần: 179,82, 141,20 và 125,92 mg tương ứng dextrin, đường mía và carboxylmethyl cellulose. Hàm lượng carbohydrate và loại carbohydrate ảnh hưởng lên độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn (p<0,05); đồng thời, sự tương tác giữa hàm lượng và loại carbohydrate cũng tác động lên độ đồng nhất khối lượng của viên hoàn (p<0,05) (Hình 3.17 đến 3.20). Biên độ dao động khối lượng viên hoàn chứa