CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của viên hoàn
2.2.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA) được xác định theo phương pháp của Dang Buu Tung Thien và cộng sự [65], lấy 100 µl dịch chiết viên hoàn bổ sung 900 µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch A (H2SO4 0.6 M, sodium phosphate
28 mM và ammonium molybdate 4 mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 95oC, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 695 nm với chất chuẩn là acid ascorbic.
2.2.1.2. Hoạt tính khử sắt
Hoạt tính khử Fe (RP) được xác định theo Zhu và cộng sự [66]: lấy 500 µl dịch chiết viên hoàn bổ sung 0,5 ml đệm phosphate pH 7,2 và 0,2 ml K3[Fe(CN)6] 1 %. Giữ hỗn hợp 20 phút ở 50oC. Sau đó thêm vào 500µl CCl3COOH 10 % với sự bổ sung 300 µl nước cất và 80 µl FeCl3 0,1 %. Lắc đều và đo ở bước sóng 655 nm với chất chuẩn là FeSO4.
2.2.1.3. Hoạt tính chống oxy hoá dựa trên hình thành diene liên hợp
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol, chlorophyll được đánh giá dựa trên việc kiểm soát sự hình thành diene liên hợp (conjugated diene) do LDL bị oxy hóa bởi Cu2+ và bước sóng sử dụng để kiểm soát là 234 nm [67]. Chuẩn bị LDL (100 µg of protein/mL) vào một giếng và bổ sung 0,01 ml dịch chiết. Thể tích cuối cùng của mỗi giếng được điều chỉnh bằng nước đề ion để đạt 0,2 ml. Tiếp theo bổ sung dung dịch Cu2+ 0,1 mM vào mỗi giếng sao cho nồng độ Cu2+ cuối cùng đạt 5 µM và kiểm soát hình thành diene liên hợp được ở bước sóng 234 nm trong 4 giờ ở 37°C. Pha trễ (lag phase) được xác định bằng đồ họa.
2.2.1.4. Hoạt tính chống oxy hoá dựa trên hoạt tính ức chế của enzyme catalase (CAT)
Dựa trên phản ứng phá hủy H2O2 của dịch chứa hoạt chất trong môi trường trung tính [68]. Chuẩn bị 3 ml hỗn hợp bao gồm 100 mM đệm sodium phosphate (pH 7,0), 30 mM H2O2 và 100 µL hỗn hợp hoạt chất và đo hỗn hợp ở bước sóng 240 nm. 01 đơn vị (U) hoạt tính được xác định dựa vào sự biến đổi độ hấp thụ 0,001/ phút trong điều kiện thử nghiệm.
2.2.1.5. Hoạt tính lipoprotein mật độ thấp (LDL) (Phương pháp TBAR)
Dựa theo phương pháp của Buege và cộng sự [69]. LDL (100 µg of protein/mL) được giữ ở nhiệt độ phòng cùng với mẫu. Sau đó bổ sung 5 µmol/L CuSO4 vào hỗn hợp và giữ 2 giờ ở 37oC. Quá trình oxy hóa khử Cu2+ được kết thúc bằng cách bổ sung butylated hydroxytoluene (BHT, 10 µM). Mức độ oxi
hóa LDL được xác định dựa trên hàm lượng peroxides lipid được tạo ra và đo ở bước sóng 532 nm. Cơ chất sử dụng là acid thiobarbituric và malondialdehyde (MDA) sử dụng như chất chuẩn.
2.2.1.6. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được đánh giá theo phương pháp Blois [70]. Lấy lần lượt 200 µl, 400 µl, 600 µl, 800 µl và 1000 µl dịch chiết vào 5 ống nghiệm, rồi bổ sung 3 ml DPPH (25 mg/l) vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tương tự mẫu nhưng thay DPPH bằng 3 ml cồn tuyệt đối vào từng ống. Mẫu kiểm soát chuẩn bị bằng cách làm giống như mẫu trắng nhưng thay dịch chiết bằng DPPH. Giữ các hỗn hợp trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. Công thức tính phần trăm bắt gốc như sau:
DPPH %=[1- (Amẫu− Amẫu trắng
Akiểm soát )] × 100%