CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2.4.1.Phương pháp đĩa thạch
1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE
1.2.4.1.Phương pháp đĩa thạch
Phương pháp đĩa thạch alginate là một trong những phương pháp phổ biến. Lợi ích của phương pháp này là thân thiện, đơn giản, dễ thực hiện, có thể sử dụng để sàng lọc lượng lớn vi sinh vật và tiết kiệm thời gian.
Nguyên tắc của phương pháp đĩa thạch có chứa alginate: là nuôi cấy vi sinh vật lên đĩa thạch có chứa cơ chất là alginate. Vi sinh vật nếu sản sinh alginate lyase, enzyme này sẽ bẻ ngắn mạch alginate tạo các sản phẩm có KLPT thấp, sản phẩm này không bị bắt màu bởi các loại thuốc thử đặc trưng, tạo ra vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Vùng bị nhuộm màu là alginate KLPT cao. Có nhiều loài thuốc thử khác nhau để phát hiện sàng lọc alginate lyase từ vi sinh vật được các nhà khoa học sử dụng và công bố.
Năm 1990, Peter Gacesa đã sử dụng 0,1% polyguluronate và polymannuronate từ alginate để làm cơ chất trong môi trường đĩa thạch, sau đó cho vi khuẩn phát triển trên đĩa môi trường. Chủng vi khuẩn được cho là có khả năng sinh alginate lyase là chủng mà tạo ra được vòng phân giải trên đĩa thạch sau khi nhuộm với cetyl pyridinium clorua (CPC) hoặc đỏ
ruthenium [49]. Takeshita và cộng sự [50] đã phát triển một phương pháp cải tiến dựa trên việc sử dụng song song thuốc thử phổ biến hơn đó là canxi clorua cùng với 70% etanol nhằm kết tủa alginate không bị phân giải bởi enzyme trong môi trường thạch đĩa. Baron và cộng sự [51] đã sử dụng 1,5% agarose và 1% natri alginate giàu G chiết xuất từ loài từ loài rong Laminaria hyperborea nhằm xác định tính đặc hiệu của alginate lyase đối với poly G từ loài vi khuẩn Klebsiella pneumoniae được biểu hiện trên Escherichia coli. Với việc sử dụng các thuốc thử nêu trên khó quan sát bằng mắt thường. Đến năm 2015, Sawant và cộng sự đã phát triển phương pháp này bằng cách sử dụng thuốc thử Gram’s iodine. Gram’s iodine tạo thành phức màu đen hơi xanh với alginate KLPT cao nhưng không tạo phức với alginate bị thủy phân, tạo ra các vùng sắc nét, rõ ràng xung quanh các khuẩn lạc vi sinh vật chỉ trong vòng 2-3 phút nhuộm. Phương pháp sử dụng Gram’s iodine được phát hiện có hiệu quả hơn phương pháp sử dụng CPC làm thuốc thử về hình ảnh và dễ dàng đo kích thước vùng phân giải [52].