STT Vi khuẩn biển Đặc hiệu
enzyme Khối lượng phân tử (kDa) pH Nhiệt độ (toC) Đặc tính xúc tác, ảnh hưởng của các
ion kim loại
Nguồn tài liệu tham khảo
1 Vibrio furnissii H1 Poly M/
poly G 35,8 7,5 30
NaCl 0.3M, Zn2+, Fe2+, Cu2+,
Mn2+, Ag+
[64]
2 Bacillus sp. Alg07 Poly M 60 7,5 40 NaCl 0.2 M, Mg2+, Ca2+ [3] 3 Serratia marcescens NJ – 07 Poly M 25 9 40 NaCl từ 0.1- 0.3M, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Na+ [74] 4 Isoptericola halotolerans NJ-05 Poly M/ poly G 25,32 7 40 NaCl 0.1- 0.3M, Na+, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [75]
5 Flavobacterium sp. UMI-01 PolyM 30 7,5 55 NaCl 100 mM, MgCl2 , CoCl2, NiCl2 5mM [76] 6 Pseudoalteromonas sp. SM0524 Poly M/ poly G 32 8,5 50 NaCl 0.2M, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Co2+ Ba2 +, Ni2+ và Sr2. [7] 7 Enterobacter cloacae M-1 poly G 32 7,8 30 , EDTA, CaCl2, AlCl3, MnCl2, Mg2+, Ca2+ , Cu2+ , Co2+, Fe3+ [78]
8 Vibrio harveyi AL-
128 poly G 57 7,8 NaCl từ 0,3-1M Zn2+, Hg2+, Ag +, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+ [66] 9 Alteromonas portus HB161718T Poly G 60 8 25 NaCl 0.1M, KCl 0.1M, Mg2+, Ca2 + và K+ Zn2+, Co2 + Li+ [79] 10 Bacillus sp. Poly G 60 8 50 NaCl 1.2 M, Mg2+, Ca2+, K+, Zn2+,Co2+,Li+ [80]
Các alginate lyase thu nhận từ các vi khuẩn biển Vibrio sp. được nghiên cứu phân lập, công bố có đặc trưng về điều kiện nhiệt độ từ 16oC – 40oC, pH 6,5-8,5 và ảnh hưởng bởi nồng độ muối NaCl cũng như các ion kim loại hóa trị II. Trong đó, Alginate lyase từ Vibrio furnissii H1 có KLPT 35,8 kDa, hoạt động tối đa ở nhiệt độ 40oC được xem hoạt động nhiệt độ cao nhất trong số các các enzyme từ Vibrio sp. và ổn định nhiệt ở 30oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase hoạt động là 300 mM. Hoạt động của enzym bị ức chế bởi Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ và Ag+. Tuy nhiên, K+ và Mg2+ thể hiện tăng cường hoạt động enzyme [64].
Mỗi loài vi khuẩn sinh ra alginate lyase có những đặc tính khác nhau như KLPT, điều kiện hoạt động và tính đặc hiệu cơ chất. Alginate lyase có
nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 có KLPT khoảng 60 kDa, hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase là 200 mM, Mg2+, Ca2+ tăng cường sự hoạt động của enzyme. Là một alginate lyase đặc hiệu poly M và trong điều kiện tối ưu đạt tới 8306,7 U/mg và được xem là hoạt động cao nhất trong số các alginate lyase [3]. Vì vậy, alginate lyase có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp. Alg07 được đánh giá là có tiềm năng rất lớn để sản xuất quy mô công nghiệp.
Alginate lyase từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens NJ – 07 được Benwei Zhu và công sự (2019) công bố, Aly NJ-07 chỉ đặc hiệu với poly M có KLPT 25 kDa và thể hiện mức hoạt động tối đa 2742,5 U/mg đối với muối natri alginate, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 9, NaCl từ 100 – 300 mM. Tác giả nhận thấy rằng Na+ có thể tăng cường hoạt động của enzyme, trong khi một số ion hóa trị hai như: Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+ ức chế hoạt động của enzyme. Aly NJ-07 là endolytic có khả năng nhận biết trisaccharide và phân cắt các trisaccharide thành monosaccharide và disaccharide [74].
Alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G được thu nhận từ chủng vi khuẩn Isoptericola halotolerans NJ-05 phân lập từ rong nâu có KLPT 25,32 kDa, enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 7, các ion kim loại Na+, Mg2+, Ca2+ có thể tăng cường sự hoạt động của enzyme trong khi các ion Cu2+, Co2+, Fe3+ lại ức chế sự hoạt động của alginate lyase. Do enzyme đặc hiệu cả poly M và poly G nên nó có thể thủy phân alginate giải phóng một loạt các oligosaccharide như disaccharide, trisaccharide và tetrasaccharide [75].
Alginate lyase thuộc họ polysaccharide lyase số 7 đặc hiệu poly M từ loài vi khuẩn biển Flavobacterium sp. UMI-01 có KLPT 30 kDa, điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme ở nhiệt độ 55oC, pH = 7,7, NaCl 100mM và MgCl2 5mM tăng cường hoạt động của enzyme thêm 30% trong khi CoCl2 5mM và NiCl2 5mM thì có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Đây là chủng vi khuẩn biển sinh enzyme alginate được đánh giá có khả năng cao trong sản xuất alginate oligosaccharide vì chúng có hiệu suất xúc tác cao [76].
Chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas sp. SM0524 được phân lập từ tảo bẹ biển bị thối rữa sinh alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G. KLPT enzyme 32 kDa hoạt động trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ 50oC, pH 8,5. Nồng độ NaCl tối ưu là 0,2 M và chịu tác động của ion kim loại Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ba2+, Ni2+ và Sr2+. Đây là enzyme tiềm năng để sản xuất alginate KLPT thấp [7].
Alginate lyase đặc hiệu poly G từ vi khuẩn được phân lập ở rong
Sargassum fluitans cho thấy chúng hoạt động mạnh khi có mặt của NaCl 0,5M, enzyme có KLPT 38 kDa và có pI = 4,5 [77]. Hoặc đối với enzyme alginate lyase đặc hiệu poly G từ Enterobacter cloacae M-1 có KLPT 38 kDa và 32 kDa, pI = 8,9, pH = 7,8, nhiệt độ thích hợp là 30oC, enzyme không bền với nhiệt, EDTA hoàn toàn ức chế hoạt tính của enzyme, nhưng hoạt tính của enzyme phục hồi lại được khi xử lý với CaCl2, AlCl3, MnCl2, các ion Mg2+, Ca2+, Cu2+, Co2+, Fe3 ức chế sự hoạt động của enzyme [78].
Enzyme alginate ngoại bào từ vi khuẩn Vibrio harveyi AL-128 có KLPT 57 kDa, hoạt động tốt ở nồng độ NaCl từ 0,3-1M, các ion Zn2+, Hg2+, Ag+, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+, EDTA ức chế hoạt động của enzyme, [66].
Ngoài những alginate lyase hoạt động theo endolytic hay exolytic thì có những enzyme hoạt động cùng lúc cả endolytic và exolytic như enzyme Alg2951 từ vi khuẩn Alteromonas portus HB161718T KLPT 60 kDa hoạt động tối đa ở nhiệt độ 25oC, pH 8. Cả NaCl 100 mM, KCl 100 mM đều thúc đấy sự hoạt động của enzyme. Các ion kim loại Mg2+, Ca2+ và K+ làm tăng hoạt tính của enzyme trong khi Zn2+, Co2+ và Li+ ức chế mạnh. Alg2951 đặc hiệu poly G thủy phân alginate thành các monosaccharide và trisaccharide [79].
Năm 2019, Zilda và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn từ rong
Turbinaria, vi khuẩn phân lập thuộc loài Bacillus sp. sinh alginate lyase T513. Enzyme hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ 50oC, pH 8, các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme gồm: Mg2+, Ca2+, K+, Zn2+, Co2+, Li+, nồng độ NaCl ở 1,2 M thì enzyme không hoạt động. Đây là một trong ít chủng vi khuẩn phân lập từ rong Turbinaria được công bố [80].
1.3.3. Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu alginate lyase vẫn còn trong giai đoạn tìm kiếm, bước đầu đã nghiên cứu tách chiết được enzyme từ một số nguồn vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và động vật thân mềm.
Nguyễn Ngọc Hữu [81] đã nghiên cứu tách chiết được enzyme thủy phân alginate từ loài vi khuẩn Klebsiella sp. có hoạt độ xác định theo phương pháp độ nhớt là 12ml/20phút (nghĩa là với 12ml dung dịch enzyme thủy phân cắt mạch alginate làm cho độ nhớt dung dịch alginate 1% giảm xuống 50% trong 20 phút). Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme từ 30oC - 40oC. Đây là nghiên cứu bước đầu về khả năng cắt mạch alginate của alginate lyase từ vi khuẩn Klebsiella sp.. Các enzyme thu được chưa tinh sạch, chưa xác định được đặc tính xúc tác đặc hiệu của enzyme.
Ngô Thị Duy Ngọc [82] đã nghiên cứu thu nhận enzyme alginate lyase từ ốc bàn tay (Lambis chiragra) và nhận thấy enzyme có KLPT khoảng 32 kDa, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động là 40oC, pH thích hợp từ 7,5 ÷ 8,0, nồng độ NaCl 0,2M cho hoạt động cao nhất. Các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Mn2+) có tác dụng hoạt hóa enzyme, còn đối với các ion Ag+, Cu2+, Fe2+, Zn2+ lại ức chế hoạt tính enzyme.
Năm 2020, Võ Thị Diệu Trang và cộng sự đã nghiên cứu được 35 chủng vi khuẩn biển từ bọt biển sinh enzyme cắt mạch polysaccharide trên chất nền alginate, fucoidan được chiết xuất từ rong nâu S. mcclurei. Trong đó, có 68,6% chủng sinh alginate lyase trên chất nền alginate từ S. mcclurei. Công trình nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn trong việc tìm kiếm các vi khuẩn biển sinh alginate lyase đặc hiệu ở Việt Nam [83]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các công trình nghiên cứu về chủng vi khuẩn biển B. velezensis
AlgSm1 đã được công bố có khả năng sinh alginate lyase bẻ mạch alginate chiết từ rong S. mcclurei thu nhận tại vùng biển Khánh Hòa [83]. Cao Thị Thúy Hằng và công sự [85] đã tiên hành khảo sát điều kiện lên men của chủng vi khuẩn này và xác định điều kiện sản sinh alginate lyase tốt nhất là
pH 5,5, nguồn carbon là alginate 5 mg/ml, nguồn nitơ là 0,8 mg/ml, thời gian lên men là 18 giờ, nuôi cấy ở 28-30°C. Đây là cơ sở cũng như là tiềm năng nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh alginate lyase ở nước ta nơi vùng biển có trữ lượng lớn về rong nâu để sản xuất alginate.
Như vậy, ở Việt Nam hiện nay chúng ta cần phải tiếp tục tìm kiếm và xác định đặc tính xúc tác của alginate lyase nhằm cung cấp công cụ để sản xuất alginate oligosaccharide ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, thực phẩm chức năng và y dược.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực nghiệm: từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2021
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1 Vật liệu thí nghiệm
2.2.1.1. Nguồn cơ chất
Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei (S. mcc A) và
Turbinaria ornata (T. o A) được cung cấp bởi phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. S. mcc A có KLPT 505 kDa, T. o A có KLPT 325 kDa được xác định bằng phương pháp sắc ký GPC (Phụ lục 1), hàm lượng uronic acid tổng số lớn hơn 90%.
2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểmcủa vùng biển Khánh Hòa ở độ sâu 3-5m vào tháng 4/2021 (hình 2.1). Các mẫu rong biển sau khi được thu thập, phân loại được cho vào túi trữ mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 4ºC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Quá trình thu mẫu đã thu được 05 mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa (hình 2.1) gồm: (1) rong Hormophysa articulate, (2) rong Sargassum oligocystum, (3) rong Turbinaria ornata, (4) rong Padina australis, (5) rong
Sagassum polycystum.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ: - Đĩa petri - Que cấy trang - Que cấy vòng
- Ống Cryotube để giữ giống
- Các loại ống đong 100ml; 500ml;1000ml - Bình tam giác 500ml; 1000ml
- Pipet
- Nước biển vô trùng đựng trong bình tam giác
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Cân phân tích CP224S Sartorius 31
- Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ
- Máy đo quang: SHIMADZU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER
2.2.3. Môi trường nuôi cấy.
Môi trường phân lập MBA: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:
- Pepton: 10g - Alginate: 10g - KH2PO4: 0,1g - MgSO4.7H2O: 0,1g - Nước cất: 500ml - Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường MB lỏng để lưu giữ giống: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:
- Pepton: 5g
- Alginate chiết từ rong S. mcclurei: 10g - Yeast extract: 1g
- KH2PO4: 0,1g - MgSO4.7H2O: 0,1g - Nước cất: 500ml - Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển
Môi trường MBA lỏng để lên men vi khuẩn: Các thành phần cho 01
lít nước bao gồm: - Pepton: 5g
- 0,5%Alginate chiết từ rong S. mcclurei: 5g - Yeast extract: 1g
- KH2PO4: 0,2g
- MgSO4.7H2O: 0,05g - Nước cất: 500ml
- Nước biển: 500ml
- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển
Thuốc thử Gram’s iodine để thử nghiệm hoạt tính enzyme:
Gram Iod (IX):
- Kali iodide (KI): 2g - I2: 1g
- Nước cất: 300ml
- Cetavlon (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) 10% (stock):
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài đã được thực hiện theo sơ đồ tổng quát Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài
2.3.1. Xử lý mẫu
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểm của vùng biển Khánh Hòa được cho vào các túi zip, mỗi mẫu rong được cho vào mỗi túi và bảo quản ở nhiệt độ 15-200C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Các mẫu rong nâu sau khi được thu đưa về phòng thí nghiệm sẽ được tiến hành xử lý mẫu ngay trong ngày, các mẫu sẽ được phân loại, chụp hình,
Thu và xử lý các mẫu rong nâu
Phân lập vi khuẩn biển theo định hướng sinh
alginate lyase
Sàng lọc chủng hoạt tính cao để định danh
Lên men, thu nhận, xác định đặc tính xúc tác
Bộ sưu tập vi khuẩn biển nguồn gốc từ rong nâu
Bộ sưu tập vi khuẩn biển sinh alginate lyase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dữ liệu 16S rDNA
Lên men thu nhận enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của ion hóa trị II Ảnh hưởng của NaCl
mã hóa, trích mẫu định danh (Hình 2.2). Phần mẫu còn lại sẽ được sử dụng để phân lập vi khuẩn biển. Mẫu rong được rửa ba lần với nước biển vô trùng để loại bỏ vi sinh vật ngoại nhiễm, sau đó sử dụng cối sứ đã được vô trùng nghiền nát để thu dịch mẫu (xem phụ lục 1 các Hình P 3, Hình P 4).
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển
Phương pháp phân lập vi khuẩn từ các mẫu rong nâu được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Thuận và cộng sự [84]. Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ Hình 2.3. Cụ thể:
Một gam (g) mẫu được đồng nhất với 10ml nước biển vô trùng. Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. Cấy trang 100µl mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 dịch lên đĩa thạch chứa môi trường phân lập có bổ sung alginate từ rong S. mcclurei làm nguồn carbon chỉ thị (MBA). Để phân lập vi khuẩn biển đĩa thạch MBA được ủ ở 30oC. Sau 1-5 ngày, khuẩn lạc rời có đặc điểm hình thái khác nhau được cấy chuyển trên môi trường MB (không có chứa alginate) để có khuẩn lạc thuần, đơn lẻ.
Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Mỗi khuẩn lạc rời được cấy chuyển ít nhất 3 lần để đảm bảo về độ thuần chủng. Vi khuẩn được gọi là thuần khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.
Chủng vi khuẩn thuần chủng được mã hóa và lưu giữ trong môi trường MB lỏng (không có chứa agar) bổ sung 30% glycerol (v/v), giữ ở - 80oC thuộc bộ sưu tập vi sinh vật biển của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn biển từ rong biển 2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh 2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase
Khả năng sinh chuyển hóa alginate của các vi khuẩn đánh giá bằng phương pháp đĩa thạch chứa cơ chất mục tiêu là S. mcc A [52]. Cụ thể, Lấy một khuẩn lạc của vi khuẩn thuần chủng cấy lên đĩa thạch alginate, mỗi đĩa thạch cấy ít nhất 5 chủng vi khuẩn, các đĩa vi khuẩn được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Sau đó, sinh khối tế bào được loại bỏ khỏi bề mặt thạch
Rong biển
Rửa bằng nước biển vô trùng
10 ml nước biển+ 1g mẫu