2.3.3. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase
Khả năng sinh chuyển hóa alginate của các vi khuẩn đánh giá bằng phương pháp đĩa thạch chứa cơ chất mục tiêu là S. mcc A [52]. Cụ thể, Lấy một khuẩn lạc của vi khuẩn thuần chủng cấy lên đĩa thạch alginate, mỗi đĩa thạch cấy ít nhất 5 chủng vi khuẩn, các đĩa vi khuẩn được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Sau đó, sinh khối tế bào được loại bỏ khỏi bề mặt thạch
Rong biển
Rửa bằng nước biển vô trùng
10 ml nước biển+ 1g mẫu rong
Nghiền nát mẫu thành dịch huyền phù, pha loãng
Hút 100 µl dịch vào môi trường MBA
Kiểm tra và quan sát
Cấy chuyển làm thuần chủng vi khuẩn trên môi trường MB
Chọn chủng vi khuẩn, giữ mẫu ở - 80oC
Ủ ở 30°C từ 1-5 ngày
bằng que cấy, sửa sạch sinh khối trên mặt thạch bằng nước cất. Tiến hành đổ ngập mặt thạch thuốc nhuộn Gram’s iodine trong 25 phút. Chủng vi khuẩn được xác định là có khả năng sinh alginate lyase khi vùng thử nghiệm của chúng không bị nhuộm màu bởi thuốc nhuộm mà tạo ra vùng trong suốt (vòng phân giải). Chủng vi khuẩn biển tạo ra vòng phân giải alginate với đường kính lớn nhất và rõ ràng nhất được lựa chọn để định danh.
2.3.4. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được lựa chọn để định danh bằng phương pháp so sánh trình tự gen 16S rRNA. Sử dụng cặp mồi 533F:
5’GTGCCAGCAGCCGCGGTAA3’ và 1496R:
5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’ để nhân gen mã hóa đoạn 16S rRNA của vi khuẩn phân lập được. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, tinh chế bằng bộ QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Trình tự nucleotide của gen 16S rRNA tinh sạch được giải bằng phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI 3130XL (313001R, Thermo Fisher Scientific, USA) tại Phòng xét nghiệm Công ty TNHH DV và TM Nam Khoa (Thành phố Hồ Chí Minh). Các trình tự được xử lí bằng các chương trình BLAST/NCBI và tiến hành so sánh trình tự gen của các chủng nghiên cứu với một số chủng khác từ Ngân hàng gen thế giới (National Center for Biotechnology Information/NCBI) [83].
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate
2.3.5.1. Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase
Chủng vi khuẩn biển đã tuyển chọn được lên men như sau: Chủng vi khuẩn thuần chủng được lên men trong 200 ml môi trường MBA lỏng có chứa: yeast extract 0,8 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; MgSO4.7H2O 0,05 g/l; nước biển 500 ml, nước máy 500 ml và 0,5g/l alginate chiết từ rong S. mcclurei; pH= 5,5 ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ với tốc độ lắc 180 vòng/phút [85].
Dịch lên men sau 18 giờ, đem đi ly tâm 6.000rpm trong 30 phút ở 10oC. Thu dịch nổi để kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào. Phần sinh khối
được huyền phù hóa lại với đệm Tris HCl 0,02 M pH 7,0. Sau đó ly tâm 6000rpm trong 30 phút ở 10oC để loại bỏ hoàn toàn dịch ngoại bào. Thu lại sinh khối, cấp đông qua đêm để tăng hiệu suất phá vỡ tế bào. Tái huyền phù với đệm Tris HCl 0,02M pH 7,0 phá vỡ tế bào bằng sonication, ly tâm 6000rpm trong 30 phút ở 10oC để phá vỡ thành tế bào thu dịch enzyme nội bào. Kiểm tra hoạt tính alginate lyase của dịch ngoại bào và nội bào. Lựa chọn phần có hoạt tính cao để tiến hành bước tinh sạch sơ bộ tiếp theo tiếp theo [85].
2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn
Dịch enzyme ngoại được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa với muối (NH4)2SO4. Đây thường là bước đầu tiên để tinh sạch alginate lyase từ vi khuẩn biển [85], cụ thể như sau: Dịch chiết thô enzyme được tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 80%. Thực hiện kết tủa trong 24 giờ ở 4oC, sau đó li tâm 30 phút ở nhiệt độ 10oC, 12.000rpm và thu nhận phần tủa. Sau đó phần kết tủa được huyền phù lại trong 20ml đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5. Thẩm tách dịch huyền phù qua màng thẩm tách 10kDa trong đệm, ở nhiệt độ 4oC, qua đêm để loại muối (NH4)2SO4.
Thử nghiệm hoạt tính enzyme: Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl enzyme đã pha loãng ở nồng độ 0,1 mg protein/ml và 1900µl S. mcc A nồng độ 10mg/ml pha trong đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 và 200 mM NaCl. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó, dừng phản ứng bằng cách thêm 20 µl NaOH 10M. Ghi nhận bước sóng 235 tại thời điểm 0 phút và 30 phút. Hoạt tính alginate lyase được tính bằng sự gia tăng bước độ hấp thụ ở bước sóng OD235 [3]. Một đơn vị hoạt tính (U) được xác định là lượng enzyme cần thiết để gia tăng độ hấp thụ tại bước sóng 235 nm lên 0,1 trong 1 phút.
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry[85] với chuẩn là albumin.
+ Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N + Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất + Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất
- Lấy 0,5ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25ml Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 660 nm. Dùng Albumin huyết thanh bò (BSA) để xây dựng đường chuẩn (Hình 2.3).